Les#premiers#résultats#de#ces#travaux#de#thèse#ont#démontré#que#la#communauté# microbienne# associée# à# l’éponge# Crambe) crambe# est# faiblement# diversifiée# et# dominée# par#une#unique#OTU#regroupant#à#elle#seule#près#de#74%#de#l’ensemble#des#séquences# obtenues# par# pyroséquencageJ454# de# l’ARNr16S# total.# Cette# OTU# est# affiliée# à# une# bêtaprotéobactérie# (Chapitre# 2).# L’utilisation# de# différentes# techniques# de# culture# des# microJorganismes# associés# à# cette# éponge# méditerranéenne# a# permis# l’isolement# de# microJorganismes#minoritairement#présents#au#sein#des#tissus#de#C.)crambe#cependant# elles#n’ont#pas#permis#l’isolement#du#microJorganisme#majoritaire#(Chapitre#3).##
L’importante# concentration# des# alcaloïdes# guanidiniques# présents# dans# les# extraits# de# C.) crambe) (environ# 0,1# à# 1%# du# poids# sec)) n’est# pas# en# faveur# d’une# biosynthèse# par# des# microJorganismes# minoritairement# associés# à# celleJci.# Cependant,# afin# de# confirmer# ou# d’infirmer# cette# hypothèse# nous# avons# comparé# la# composition# chimique#des#cultures#bactériennes#des#souches#isolées#(Chapitre#3)#et#des#tissus#de#C.) crambe#(Chapitre!4!C!Partie!1).##
Du#fait#de#la#forte#concentration#des#métabolites#secondaires#au#sein#des#tissus#de# l’éponge,# le# principal# microJorganisme# pouvant# intervenir# à# part# entière# dans# leur# synthèse#est#le#microJorganisme#majoritairement#présent#à#savoir#la#bêtaprotéobactérie# non# cultivable# à# ce# jour.# # Afin# d’apporter# des# éléments# pour# évaluer# son# possible# rôle# dans# la# biosynthèse# des# alcaloïdes# guanidiniques,# nous# avons# cherché# à# modifier# la# composition# de# la# communauté# microbienne# associée# à# C.) crambe# et# plus# particulièrement#à#affecter#l’OTU#majoritaire#par#culture#ex)situ#de#colonies#d’éponge#en# présence# d’un# stress# abiotique# par# diminution# du# pH# de# l’eau# environnante.# L’impact#
/L(0#;"'#.;*"..#.(*#'".#3,',02".#."*%#.(2D2#-%*#%0%'9."#3H2:2<("#/".#"=;*%2;.#/"#3=)"6#>4'C# c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e2+(*"#AbB##/0123#4&'!7!`!M2&4#'!.5C##
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"#$%&'!,*)#N,..2&'".#3%.#/"#F2+(*".#";#20;"*-*1;%;2,0.#/"#'L"=-1*2"03"#/"#.;*"..#-qC# !L20;"*-*1;%;2,0# /".# *1.(';%;.# /"# 'L1;(/"# -*1'2:20%2*"# /"# .;*"..# ?-%*;2"# )B# ";# '".# 3,0/2;2,0.# %0%'9;2<(".# /".# "=;*%2;.# &*(;.# /"# 3=) "6#>4') ,-;2:2.1".# %(# 3,(*.# /"# 3"#Probable lien micro-organismes métabolites secondaires - Pas de lien micro-organismes métabolites secondaires - ! vie des métabolites ?
- Pas de lien micro-organismes métabolites secondaires ou - altération métabolique du micro-organisme
dans# cette# éponge.# Ceci# nous# a# amené# à# compléter# sa# carte# d’identité# chimique# et# a# purifier# un# nouvel# alcaloïde,# mis# en# lumière# lors# de# l’expérience# de# stress# et# dont# la# structure# apporte# des# éléments# de# réflexion# sur# la# biosynthèse# des# alcaloïdes# guanidiniques#de#C.)crambe##(Chapitre!4!C!partie!3).##
Pour# finir,# nous# nous# sommes# intéressés# à# la# localisation# in) situ# des# alcaloïdes# caractérisés# dans# cette# éponge# en# imagerie# par# spectrométrie# de# masse# MALDIJTOF# («#MatrixJAssisted#Laser#Desorption#Ionization#–#Time#Of#Flight#»)#et#TOFJSIMS#(«#Time# Of#Flight#–#Secondary#Ion#Mass#Spectrometry#»).#Les#expériences#de#spectrométrie#ont# été# réalisées# à# l’Institut# de# Chimie# des# Substances# Naturelles# de# GifJsurJYvette.# La# distribution# spatiale# des# métabolites# secondaires# peut,# en# effet,# apporter# des# informations#sur#leur#rôle#au#sein#de#ces#invertébrés#mais#également#des#pistes#quand#à# l’organisme#producteur#(dans#le#cas#des#associations)#ou#le#type#cellulaire#dans#lequel#ils# sont#potentiellement#stockés.#L’étude#de#faisabilité#et#les#premiers#résultats#sont#rédigés# sous# format# d’une# publication# dans# la# dernière# partie# de# ce# chapitre# (Chapitre! 4! C! partie!4).! ! ! ! # # # # # # # #
!
Partie 1. Comparaison des empreintes chimiques des bactéries obtenues
lors de la procédure d’acclimatation et des tissus de Crambe crambe
Introduction
La# culture# de# microJorganismes# associés# aux# éponges# a# permis# d’attribuer# la# synthèse#de#certains#métabolites#secondaires#extraits#de#ces#invertébrés#à#leurs#microJ organismes# associés# (Introduction# –# Chapitre# 3).# L’étude# de# la# diversité# bactérienne# cultivable# associée# à# C.) crambe# par# la# procédure# d’acclimatation# ou# encore# les# milieux# sélectifs#a#conduit#à#l’isolement#de#nombreuses#souches#bactériennes#appartenant#pour# certaines#à#un#nouveau#genre#probable#et#une#possible#nouvelle#espèce.##Bien#que#ces# microJorganismes# isolés# soient# minoritaires# au# sein# de# la# communauté# microbienne# associée#à#C.)crambe,#et#que#l’importante#concentration#en#alcaloïdes#guanidiniques#des# extraits#ne#soit#pas#en#faveur#d’une#biosynthèse#par#des#microJorganismes#minoritaires,# leur# possible# implication# ne# peut# pas# être# complètement# exclue.# C’est# pourquoi# nous# avons# comparé# les# empreintes# chimiques# des# souches# isolées# à# celle# des# tissus# de# C.) crambe.##
Le#protocole#d’extraction#et#d’analyse#des#métabolites#bioactifs#de#C.)crambe#a#été# optimisé# à# partir# du# protocole# standardisé# «#ECIMAR#».# ECIMAR# («#Ecologie# ChImique# MARine,#indicateurs#de#biodiversité#et#valorisation#»)#est#un#programme#mis#en#place#en# 2006#afin#d’évaluer#la#bioJ#et#chimiodiversité#méditerranéenne#à#travers#divers#axes#de# recherches# centrés# autour# de# l’écologie# chimique# marine.# Ce# projet# a# été# soutenu# par# l’Agence# Nationale# de# la# Recherche# (ANR# Biodiversité)# et# l’Institut# de# Chimie# des# Substances#Naturelles#(ICSN).#Il#a#regroupé#des#biologistes#et#des#chimistes#marins,#dont#
ceux#de#l’USR#3278#de#l’Université#de#Perpignan.#Dès#la#création#du#programme#ECIMAR,# un#protocole#standardisé#d’extraction#et#d’analyse#a#été#mis#au#point#afin#d'enregistrer# les# signatures# chimiques# de# tous# les# organismes# prélevés# au# sein# de# la# communauté# modèle# étudiée# permettant# d’obtenir# des# résultats# (chromatogrammes)# homogènes,# reproductibles#et#comparables#entre#les#différentes#équipes#partenaires.#Au#cours#de#cet# inventaire#de#la#chimiodiversité#méditerranéenne,#des#espèces#dites#«#modèles#»#ont#été# sélectionnées#et#récoltées#dans#les#sites#explorés.#C.)crambe#est#une#des#espèces#choisies# dans#le#phylum#des#spongiaires.#Les#signatures#chimiques#acquises#(chromatogrammes# enregistrés#à#partir#des#extraits#récoltés#au#Liban,#en#Corse,#en#Grèce#et#à#Marseille)#sont#
téléchargeables# à# partir# de# la# base# de# données# du# portail#
ECIMAR#(http://www.ecimar.org/).#La#signature#chimique#correspond#à#une#«#image#»,# à#un#temps#et#dans#des#conditions#donnés,#de#la#composition#chimique#de#l’organisme.# Un# exemple# de# signature# est# donné# ciJaprès# (Figure# 19).# Les# alcaloïdes# guanidiniques# présents# dans# l’extrait# d’éponge# sont# principalement# élués# entre# 25# et# 30# minutes,# absorbent# en# UV# à# 254# et# 280# nm# et# sont# très# nettement# visibles# avec# le# détecteur# à# diffusion#de#lumière#(ELSD).#Ces#travaux#antérieurs#ont#servi#de#base#à#la#mise#au#point# de#protocoles#d’extraction#et#d’analyses#optimisés#utilisés#dans#ce#chapitre.# # # # # #
"#$%&'!,+)##`2+0%;(*"#3H2:2<("#^d#Aa@#J#@f@fAf5%]JY]#?QC#$H,:%.B#";#-H,;,#^d#Afg#J#@f@fAf5%]JY]#?$C# N"*"_B# /"# 3=) "6#>4'# *13,';1# G# 5%*."2''"# ?.,(*3"# &%."# /"# /,001".# .2;"# Vc^56\# H;;-IWWWC"32:%*C,*+3:.D)20/"=C-H-F*;,-J&%."J/"J/,00"".J-(&'2.H"*BC##