La somme des énergies d’interaction entre le chromophore et les résidus environnants est de
-16,2 kcal.mol−1pour mNeonGreen et -32,0 kcal.mol−1pourlanYFP. Cela était attendu en raison
de la meilleure efficacité de fluorescence du chromophore delanYFP. Il y a trois mutations entre
muta-Chapitre IV. Analyse de l’environnement du chromophore par calcul d’énergie d’interaction tion Q156H affaiblit une interaction très stabilisante entre le résidu 56 et la valine 54 ainsi qu’une interaction stabilisante avec Pro55, située juste au-dessus du chromophore. La mutation F115A
enlève une interaction stabilisante du chromophore dans mNeonGreen par rapport àlanYFP.
Enfin, la mutation T141S affaiblit une interaction stabilisante avec le chromophore (de -2,1 à
-0,5 kcal.mol−1). Les matrices de force de stabilisation montrent que trois paires de résidus sont
déstabilisantes en moyenne chezlanYFP : Ile57/Glu35, Tyr104/Chrom.59 et Arg195/Trp157, et
deux particulièrement stabilisantes : Gln46/Val54 et Tyr175/Val86. Dans le cas de mNeonGreen, il n’ya que deux interactions particulièrement déstabilisantes : Chrom.59/Glu35 et Ile57/His56, tandis qu’il n’y a pas d’interaction particulièrement stabilisante. Si on s’en tient aux interactions
de van der Waals stabilisantes et déstabilisantes de plus forte amplitude danslanYFP, on
s’aper-çoit qu’elles ont été réduites dans mNeonGreen. Les matrices de fréquence de déstabilisation
montrent que danslanYFP, il y a trois interactions déstabilisant de temps en temps le
chromo-phore, et ce nombre grimpe à sept pour mNeonGreen, ce qui suggère que l’évolution dirigée a significativement affectée la stabilisation du chromophore par les interactions de van der Waals.
Chapitre IV. Conclusion
D Conclusion
Au cours de cette partie de thèse, j’ai résolu la structure de des protéines fluorescentes jaune
et jaune-vertlanYFP et mNeonGreen. Cela m’a permis de rationaliser le processus d’évolution
dirigée qui a mené de la protéine tétramériquelanYFP à la protéine monomérique mNeonGreen.
Le "verdissement" entrelanYFP et mNeonGreen s’explique par un ensemble de mutations
nécéssaire pour restaurer les propriétés de fluorescence après monomérisation, mais qui ont entraîné un déplacement de quelques résidus sur l’hélice portant le chromophore et modifié significativement une interaction clef avec le nuage électronique délocalisé du chromophore. L’étude structurale de mNeonGreen m’a conduit à m’interroger sur les effets spécifiques des rayons X sur la structure de la protéine. Une étude corrélant diffraction aux rayons X et spec-troscopie d’absorption UV-visible et Raman m’ont permis de montrer un réarrangement massif des résidus de la cavité du chromophore et soit un déplacement en bloc soit la perte de la conjugaison du chromophore au niveau du pont méthylène. J’ai mis en évidence un site de fixa-tion par les ions chlorures, qui est partiellement aboli dans mNeonGreen à pH physiologique par une modification post-traductionnelle spontanée, la carboxylation d’une lysine à proximité du chromophore. Enfin, nous avons exploré le paysage énergétique de van der Waals entre le chromophore et un proche environnement afin de comprendre comment ces interactions subtiles étaient modifiées entre les deux protéines.
V CHAPITRE
Perspectives
La recherche et la visualisation des réseaux de liaisons hydrogènes est un problème complexe qui nécessite une représentation concise et interactive. L’algorithme d’extraction des données qui a été écrit (language Fortran) et son traitement de données (language Python) complexifie la procédure d’utilisation. Un effort supplémentaire est à fournir pour que l’algorithme devienne interactif, simple d’utilisation et que l’ensemble des réseaux de liaisons hydrogène soient étu-diés. Dans le cadre d’un développement logiciel, il serait intéressant d’écrire un module pour
un logiciel de représentation moléculaire graphique tel que PyMOL [DeLano, 2002],
SAM-SOM [Artemova and Redon, 2012] ou VMD [Humphrey et al., 1996]. Les coupes sagittales
permettent une représentation originale des réseaux de liaisons hydrogène. Néanmoins cette re-présentation nécessite d’être perfectionnée avec l’ajout de la densité de probabilité effective de chaque liaison hydrogène (non modulée par le réseau) et de discriminer d’une part, les liaisons hydrogène qui sont impliquées dans la stabilité des structures tertiaires (carbonyle et azote de la chaîne principale) et d’autre part, celles effectivement impliquées dans de potentiels transferts de proton. Enfin, des applications sur des systèmes biologiques comportant des transfert de protons sont à envisager comme c’est le cas dans la bactériorhodopsine, le complexe IV de la chaîne respiratoire mitochondriale et le centre réactionnel bactérien. Par ailleurs, l’étude de la dynamique des réseaux de liaisons hydrogènes appliquée aux protéines fluorescentes jaunes pourrait suggérer des pistes pour leur ingénierie et ainsi améliorer leur propriétés photophy-siques.
Le versant structural de cette thèse aura été marqué par la compréhension du processus de
monomérisation delanYFP, protéine fluorescente jaune naturelle tétramérique, en mNeonGreen,
protéine fluorescente jaune-vert monomérique. Au vu des caractéristiques photophysiques
CHAPITRE V. PERSPECTIVES des déterminants de fluorescence vers d’autres protéines peu fluorescentes afin de maximiser
leur brillance. Par ailleurs, certaines propriétés biochimiques comme le pH1/2se sont dégradées
au cours de l’ingénierie de mNeonGreen. L’étude de la dynamique des réseaux de LH delanYFP
et mNeonGreen pourrait fournir de précieux indices sur la modulation du pH1/2et de rationaliser
sa dégradation et ainsi envisager un mutant de mNeonGreen bien moins sensible aux différents
pH intra-cellulaires. L’amélioration du pH1/2 de mNeonGreen permettrait de lui conférer un
avantage supplémentaire non négligeable sur l’ensemble des autres protéines fluorescentes jaune-vert et jaune. Les récents développements en séquençage haut débit et les différentes expéditions scientifiques qui ont été entreprises au cours de la dernière décennie (expédition Tara Pacific 2016 sur la grande barrière de corail en cours) permettent d’envisager la décou-verte d’organismes portant des nouveaux gènes de protéines fluorescentes. La combinaison des techniques de mutagenèse haut débit couplées à une connaissance accrue des espèces marines potentiellement porteuses de nouveaux gènes codant pour des protéines fluorescentes est sans nul doute la voie royale pour identifier de nouvelles protéines fluorescentes à haute brillance qui
seront ensuite ingéniérées pour les besoins spécifiques de la microscopie (monomérie, pH1/2...).
Figure V.1 : Schéma synoptique d’amélioration des protéines fluorescentes jaunes intégrant les méthodes discutées au cours de la thèse.
CHAPITRE V. PERSPECTIVES L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse permet de proposer un cadre à la fois théorique et expérimental pour la compréhension des défauts des différentes protéines fluorescentes jaunes (brillance, sensibilité au pH, sensibilité aux ions chlorure). Les outils et méthodes développés vont mettre en évidence différentes pistes de mutagenèse pour remédier à ces défauts. C’est sans doute l’intégration de l’ensemble de ces méthodes et leur application à différentes PF jaune qui mènera à l’élaboration de "la" protéine fluorescente étalon dans cette gamme spectrale.