Interfaces de usuario

A avaliação dinâmica da rede metabólica também foi realizada a partir dos 148 experimentos in silico, considerando o 74º como o re- ferencial, de acordo com o pré-estabelecido no modelo estruturado (2). Assim, existem 148 tipos de estados estacionários, nos quais concentra- ções de metabólitos e fluxos reacionais são conhecidos. Logo, é possível realizar o processo descrito na Figura 3.3, considerando qualquer meta-

75 bólito da rede como x e avaliando sua influência em determinado fluxo reacional vi.

Os gráficos da Figura 4.7 esclarecem essa relação entre ganho estático e elasticidade adimensional. Quanto mais semelhante estiverem as condições experimentais da condição 74, K aproxima-se de ¯ε. Logo, ganho estático é a elasticidade adimensional da reação em avaliações descontínuas. Quanto maior [GLCe], maior a saturação do sistema e consequentemente os metabólitos apresentam a máxima interferência em vi, ocorrendo ínfimas variações nos fluxos reacionais, corroboradas pelas tendências assintóticas tanto de K quanto de ¯ε.

Figura 4.7: Comparação entre a elasticidade dimensional e o ganho estático de ATP em ATPase e de NAD em ADH1.

0 50 100 150 0.4 0.6 0.8 1 1.2 74 [GLCe] ATP em ATPase ¯ε K 0 50 100 150 −25 −20 −15 74 [GLCe] NAD em ADH1 ¯ε K

Os pontos de K, referentes ao experimento 74, na Figura 4.7, foram retirados porque ocorre a relação indeterminada 0/0. Devido à tolerância relativa do COPASI ser igual a 1 · 10−6_{, e o fluxo reacional}

no estado estacionário ser muito baixo, ocorre oscilações na curva de

KADH1

NAD , ao aproximar-se da indeterminação.

Perturbação da glicose extracelular

Uma vez revelada essa natureza do ganho estático na perspec- tiva da MCA, realizou-se a perturbação em degrau de [GLCe] na rede metabólica, variando-a de 74 a 740 mmol L−1_{. Como a perturbação é}

a mesma em todas as reações, a informação elástica discreta K revela quão impactante é a glicose extracelular no sistema.

No modelo (2), ATPase representa todos os processos de con- sumo do ATP, cujos parâmetros e a lei da taxa foram obtidos no tra- balho desenvolvido por Teusink et al. (1998) e ajustados na terceira

76

iteração do modelo estruturado aqui empregado (2). Logo, pode-se considerá-la representante do transporte ativo de H+_.

As reações TDH2, PYK2 e ADH5 têm fluxos nulos, devido aos parâmetros cinéticos definidos no modelo (2) e AK, G3PDH e G3PT não possuem comportamento referente a nenhuma ordem dinâmica tra- dicional a partir da perturbação em degrau de [GLCe]. Por isso, os parâmetros τ e K dessas reações não foram determinados.

De acordo com a Figura 4.8, HXK2, PGI, PFK, ALD e TPI possuem K ' 0, 19 mmol s−1

mmol L−1 e, na Figura 4.9, τ ' 128, 5 s. As reações

PGK, PGM, CDC19, PDC1 e ADH1 apresentam K ' 0, 38 mmol s−1 mmol L−1

e τ ' 130 s. Na fase de preparação (HXK2–PGI–PFK–ALD–TPI), a resposta do investimento de ATP à perturbação ∆[GLCe] é ligeiramente mais rápida que a de pagamento, porém o ganho estático daqueles fluxos é a metade destes. Isso se deve ao fato de a molécula FDP sofrer clivagem em DHAP e G3P, reduzindo a inércia mássica, favorecendo ao incremento do fluxo reacional a partir da fase de pagamento.

A glicólise, a descarboxilação do piruvato a acetaldeído e a redu- ção deste a etanol demonstraram uma resposta temporal similar e tal coerência foi quantificada através desses experimentos in silico em que também expôs as diferenças dinâmicas das isoenzimas.

A maior discrepância foi na fosforilação da GLCc, representada pelas isoenzimas GLK1, HXK1 e HXK2. τ atingiu uma diferença de 62,7 s entre a primeira e a terceira reações, representadas na Figura 4.9. Hexoquinase sofre uma profunda transformação conformacional indutiva ao se acoplar com a glicose. Dois domínios da proteína se aproximam em 8 Å quando ATP se liga a essa enzima. Esse movimento aproxima a molécula de ATP à de GLCc, bloqueando o acesso de H2O,

evitando a hidrólise das ligações fosfoanidrídicas do ATP (1).

Estruturalmente, sabe-se que as isoenzimas são diferentes por serem codificadas a partir de genes distintos. A partir das informa- ções apresentadas na Tabela 4.4, verifica-se que as posições dos genes responsáveis por suas codificações diferem-se, como também o compri- mento da cadeia de GLK1 diante das demais. Esta é específica para aldo-hexoses e as outras duas podem fosforilar ceto- e aldo-hexoses (49). HXK2 é a principal enzima para fosforilação da glicose, podendo atuar tanto na indução como repressão gênica pela glicose (50). As contribuições de HXK2, HXK1 e GLK1 na produção de G6P são, res- pectivamente, 95,779, 4,165 e 0,056 %.

O gráfico da Figura 4.8 demonstra que KHXK2

GLCe é praticamente

igual ao das reações da fase preparatória e, na Figura 4.9, o τHXK2 GLCe é

77 Figura 4.8: K _{mmol L}mmol s−1−1 das reações com resposta em primeira

ordem à perturbação degrau em [GLCe].

0 0.1 0.2 0.3 0.4 HXT GLK1 HXK1 HXK2PGI PFK ALDTPI TDH1 TDH3PGK PGM ENO1 ENO2 CDC19PDC1 PDC5 PDC6 ADH1 ATPasePGMT UGLT NDPK2 TRE6PS TRE6PP 0,21 1,22 · 108,87 · 10−4 −3 0,2 0,19 0,12 0,19 0,19 2,24 · 10−2 0,36 0,38 0,38 6,95 · 10−2 0,31 0,38 0,37 4,18 · 10−3 3,26 · 10−3 0,38 0,36 5,93 · 10−3 5,93 · 10−3 5,93 · 10−3 5,93 · 10−3 5,93 · 10−3 K _{mmol L}mmol s−1−1 

lados, bem como o desvio padrão da regressão não-linear, são apresen- tados em anexo.

Essas grandezas da análise dinâmica corroboraram a relevância de HXT no controle metabólico. A glicólise e a produção de etanol seguem com tempo de resposta similar ao transporte de glicose, certa- mente devido à representatividade exclusiva de HXT para essa função no modelo e ao desencadeamento metabólico. Tanto os modelos es- truturados tradicionais e os modificados, como Pritchard et al. (22) e Mendes et al. (2), respectivamente, demonstram que o controle do fluxo glicolítico em S. cerevisiae cabe, principalmente, a esse trans-

78

Figura 4.9: τ (s) das reações com resposta em primeira ordem à perturbação degrau em [GLCe].

100 120 140 160 180 200 HXT GLK1 HXK1 HXK2PGI PFK ALDTPI TDH1 TDH3PGK PGM ENO1 ENO2 CDC19PDC1 PDC5 PDC6 ADH1 ATPasePGMT UGLT NDPK2 TRE6PS TRE6PP 128,3 189,8 151,76 127,1 126,01126,25 129,49131,26 121,26131,1 130,55 130,49132,69 129,97130,41 130,89 129,23 118,85130,97 133,77 167,55 168,01 166,87 166,43166,54 τ (s)

porte. Essa característica já fora revelada também por modelos ciné- ticos tradicionais (52). Entretanto, a análise dinâmica in silico não só comprova a importância do transporte transmembrana como também a quantifica, ampliando a ideia de reação limitante para reação mais elástica.

Em anexo estão os parâmetros τ e K, com os respectivos desvios padrão da regressão não-linear, provenientes da perturbação em degrau de [GLCe], tradicional, sendo o perfil comportamental das reações em primeira ordem.

79

Tabela 4.4: Subsequências BLAST e comprimento das isoenzimas HEX1: GLK1, HXK1 e HXK2 (6).

Isoenzima Subsequência BLAST Comprimento

GLK1 (49) 2 – 500 499

HXK1 (51) 1 – 485 485

81

Capítulo 5

CONCLUSÃO

O modelo estruturado (2) representa o micro-organismo Saccha-

romyces cerevisiaeem uma ampla faixa de glicose extracelular. A con-

sistência foi comprovada também através de dados literários provenien- tes dessa espécie geneticamente modificada. Logo, o modelo quantifica o estresse metabólico ocorrido por alterações genéticas ou limitações nutricionais.

A identificação da rota metabólica mais afetada pelo meio reaci- onal foi viável pela Análise de Controle Metabólico. Em baixas concen- trações de glicose extracelular, as reações PGI e PFK apresentaram- se com a maior elasticidade absoluta, quantificando a preferência do micro-organismo à produção de etanol. Localmente, PFK é inibida a partir de [ATP] = 3,44 mmol L−1_{. Globalmente, isso ocorre em [ATP]}

= 1,69 mmol L−1_{. Entretanto, esse fenômeno não ocorre a [GLCe]}

alta.

Os Coeficientes de Resposta Particionado corroboraram essa adap- tação ao meio, através dos metabólitos NAD e ATP, via análise global das rotas. Através desses parâmetros, quantificou-se a influência da desativação da invertase extracelular e a contribuição do simporte de sacarose na rede metabólica. Sem o efeito de HXT, o ATP reduz o fluxo reacional de PFK, revelando que os produtos da hidrólise intracelular de sacarose são degradados mais lentamente, em relação à entrada dos mesmos via difusão facilitada. A a relação (Rα/Rβ)CDC19_ATP varia en-

tre 3,7–2,2, para cada [GLCc] no estado estacionário, a partir do 11º experimento. Por sempre encontrar-se positivo, RG3PDH

NAD revela que a

produção de glicerol é sempre desfavorecida, em relação a de etanol, cujo menor valor é unitário. A atividade da permease HXT afeta in- fimamente a produção de glicerol e, em relação ao etanol, é menor, porém com o mesmo perfil comportamental com HXT ausente.

82

A interdisciplinaridade entre Análise Dinâmica e Análise de Con-

trole Metabólico revelou que o ganho estático K é uma elasticidade

dimensional discreta. Quanto menor a variação no ganho estático en- tre os experimentos realizados, K torna-se a elasticidade adimensional tradicional, os quais revelam os relacionamentos local e global da rede metabólica.

A partir da perturbação em degrau tradicional de [GLCe], o ga- nho estático da fase preparatória é de aproximadamente 0, 19, e a de pagamento, 0,38 mmol s−1

mmol L−1. A glicólise possui τ ' 130 s, revelando a

discrepância de atuação das isoenzimas HEX1. HXK2, HXK1 e GLK1 possuem τ igual a 127,1 151,7 e 189,8 s, respectivamente, e as con- tribuições na produção de G6P são de 95,8, 4,17 e 0,056 %. Logo, o modelo considera HXK2 como a principal isoenzima desse processo, coerentemente com a literatura (50).

Através do conhecimento indutivo-dedutivo, modelos bioquími- cos estruturados devem ser usados paralelamente a análises cinéticas microbianas, para orientar a pesquisa e desvendar a lógica metabólica pela técnica da MCA.

5.1.

SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

• Propor rota de transporte ativo da sacarose associada com a hi- drólise enzimática interna a frutose e glicose.

• Definir cinética de degradação da frutose juntamente com a rota metabólica central apresentada nesse trabalho.

• Realizar análise sensitiva dos parâmetros cinéticos acrescentados ao modelo e validá-los de acordo com as propostas de alteração genética atual, encontradas na literatura.

83

Referências

1 NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger - Princípios de Bioquímica. [S.l.]: Sarvier, 2011.

2 SMALLBONE, K.; MESSIHA, H. L.; CARROLL, K. M.; WINDER, C. L.; MALYS, N.; DUNN, W. B.; MURABITO, E.; SWAINSTON, N.; DADA, J. O.; KHAN, F.; PIR, P.; SIMEONIDIS, E.; SPASIC, I.; WISHART, J.; WEICHART, D.; HAYES, N. W.; JAMESON, D.; BROOMHEAD, D. S.; OLIVER, S. G.; GASKELL, S. J.; MCCARTHY, J. E.; PATON, N. W.; WESTERHOFF, H. V.; KELL, D. B.; MENDES, P. A model of yeast glycolysis based on a consistent kinetic characterization of all its enzymes. FEBS Letters, v. 587, p. 2832–2841, 2013.

3 HOOPS, S.; MENDES, P. 2014. Disponível em: http: //www.copasi.org/.

4 BOLES, E.; HOLLENBERG, C. P. The molecular genetics of hexose transport in yeasts. FEMS Microbiology Reviews, v. 21, p. 85–111, 1997.

5 FERNANDES, M.; JUNIOR, A. F.; MONTEIRO, J. B. Avaliação do desempenho fermentativo de leveduras geneticamente modificadas na metabolização de sacarose. Tese (Dissertação de Mestrado) — Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), 2013. 6 EMBL-EBI. BLAST–The Basic Local Alignment Search Tool. 2014. Disponível em: http://www.uniprot.org/blast/. 7 JUNCKER, J.-C. Outubro 2014. The EU Framework Programme for Research and Innovation. Disponível em:

84

http://ec.europa.eu/research/bioeconomy/index_en.htm. 8 OLEJ, B.; FRISCHTAK, C. R.; MACHADO, J.; ENRIQUEZ, J.; FERREIRA, S. N.; GRADIN, B.; OOTANI, R. S. Bioeconomia – uma agenda para o Brasil. In: CONFEDERAÇÃO NACIONAL DA INDÚSTRIA. Harvard Business Review – Brasil. [S.l.]: Harvard Business Review Analytic Services, 2013. p. 1–40.

9 STEPHANOPOULOS, G. Laboratory for Bioinformatics and Metabolic Engineering. Abril 2015. Disponível em: http://bamel.scripts.mit.edu/gns/.

10 MIAN, R. Lançada a Associação Brasileira de Biotecnologia Industrial. Abril 2014. Disponível em:

http://www.udop.com.br/index.php?item=noticias&cod=1113093. Acesso em: Abril de 2015.

11 SCHROEDER, J. Brazilian Industrial Biote- chnology Association Formed. Maio 2014. Dis- ponível em: http://domesticfuel.com/2014/05/01/

brazilian-industrial-biotechnology-association-formed/. Acesso em: Abril de 2015.

12 MARPLES, F. Brazilian Industrial Biotechnology Association founded in São Paulo. Maio 2014. Disponível em: http://www.biofuelsdigest.com/bdigest/2014/05/05/

brazilian-industrial-biotechnology-association-founded-in-sao-paolo/. 13 SCHNEIDER, M. V.; WATSON, J.; ATTWOOD, T.; ROTHER,

K.; BUDD, A.; MCDOWALL, J.; VIA, A.; FERNANDES, P.; NYRONEN, T.; BLICHER, T.; JONES, P.; BLATTER, M.-C.; RIVAS, J. D. L.; JUDGE, D. P.; GOOL, W. van der; BROOKSBANK, C. Bioinformatics training: a review of challenges, actions and support requirements. Briefing in Bioinformatics, v. 2, p. 544–551, 2010. 14 ÖSTERLUND, T.; NOOKAEW, I.; NIELSEN, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: Developments and impacts. Biotechnology Advances, v. 30, p. 979–988, 2012.

15 SHULER, M. L.; KARGI, F. Bioprocess Engineering–Basic Concepts. [S.l.]: Prentice Hall PTR, 2009.

85 brenda-enzymes.org.

17 SCHüLKE, N.; SCHMID, F. X. The stability of a yeast invertase is not significantly influenced by glycosylation. The Journal of Biological Chemistry, v. 263, p. 8827–8831, 1988.

18 CONDE, A.; DIALLINAS, G.; CHAUMONT, F.; CHAVES, M.; GERóS, H. Transporters, channels, or simple diffusion? dogmas, atypical roles and complexity in transport systems. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 42, p. 857–868, 2010.

19 DIDERICH, J. A.; SCHEPPER, M.; HOEK, P. van; LUTTIK, M. A. H.; DIJKEN, J. P. van; PRONK, J. T.; KLAASSEN, P.; BOELENS, H. F. M.; MATTOS, M. J. T. de; DAM, K. van; KRUKEBERG, A. L. Glucose uptake kinetics and transcription of hxt genes in chemistat cultures of saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry, v. 274, p. 15350–15359, 1999.

20 CEREVISIAE, R. of Cation Balance in S. Martha s. cyert and caroline c. philpott. Genetics, v. 193, p. 677–713, 2013.

21 SCHLESSER, A.; ULASZEWSKI, S.; GHISLAIN, M.; GOFFEAU, A. Second transport atpase gene in saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry, v. 263, p. 19480–19487, 1988.

22 PRITCHARD, L.; KELL, D. B. Schemes of flux control in a model of saccharomyces cerevisiae glycolysis. European Journal of Biochemistry, v. 269, p. 3894–3904, 2002.

23 GU, Z.; CAVALCANTI, A.; CHEN, F.-C.; BOUMAN, P.; LI, W.-H. Extent of gene duplication in the genomes of drosophila, nematode, and yeast. Molecular Biology and Evolution, v. 19, p. 256–262, 2002.

24 HEAVNER, B. D.; SMALLBONE, K.; BARKER, B.; MENDES, P.; WALKER, L. P. Yeast 5 – an expanded reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. BMC Systems Biology, v. 6, p. 55–68, 2012.

25 HOOPS, S.; SAHLE, S.; GAUGES, R.; LEE, C.; PAHLE, J.; SIMUS, N.; SINGHAL, M.; XU, L.; MENDES, P.; HUMMER, U.

86

Copasi – a complex pathway simulator. System Biology, v. 22, p. 3067–3074, 2006.

26 LI, C.; DONIZELLI, M.; RODRIGUEZ, N.; DHARURI, H.; CHELLIAH, L. E. V.; LI, L.; HE, E.; HENRY, A.; STEFAN, M. I.; SNOEP, J. L.; HUCKA, M.; NOVèRE, N. L.; LAIBE, C. Biomodels database: An enhanced, curated and annoated resource for published quantitative kinetic models. BMC Systems Biology, v. 4, p. 92–106, 2010.

27 HEIJNEN, J. J.; SMOLKE, C. D. The Metabolic Pathway Engineering Handbook. [S.l.]: CRC Press, 2010.

28 SMALL, J. R.; FELL, D. A. Metabolic control analysis. European Journal of Biochemistry, v. 191, p. 413–420, 1990. 29 KACSER, H.; BURNS, J. A. The control of flux. The Society of Experimental Biology, v. 27, p. 65–104, 1973.

30 HEINRICH, R.; RAPOPORT, T. A. A linear steady- state treatment of enzymatic chains. European Journal of Biochemistry, v. 42, p. 89–95, 1974.

31 WESTERHOFF, H. V.; CHEN, Y.-D. How do enzyme activities control metabolite concentrations? European Journal of

Biochemistry, v. 142, p. 425–430, 1984.

32 KELL, D.; COWLEY, J. The Metabolic Control Analysis Web. Fevereiro 2004. Disponível em: http: //dbkgroup.org/mca_home.htm.

33 SEBORG, D. E.; EDGAR, T. F.; MELLICHAMP, D. A. Process Dynamics and Control. [S.l.]: John Wiley and Sons, Inc., 2003. 34 PERRY, R. H.; GREEN, D. W. Perry’s Chemical Engineers’ Handbook. [S.l.]: McGraw Hill, 1999.

35 HUCKA, M.; BERGMANN, F.; NOVèRE, N. L.; OLIVIER, B. G.; SAHLE, S.; WALTEMATH, D. 2014. Disponível em: http://sbml.org/.

36 CHAOUIYA, C.; BERENGUIER, D.; HEATING, S. M.; NALDI, A.; LERSEL, M. P. van; RODRIGUEZ, N.; DRäGER, A.; BüCHEL,

87 F.; COKELAER, T.; KOWAL, B.; WICKS, B.; GONçALVES, E.; DORIER, J.; PAGE, M.; MONTEIRO, P. T.; KAMP, A. von; XENARIOS, I.; JONG, H. de; HUCKA, M.; KLAMT, S.; THIEFFRY, D.; NOVèRE, N. L.; SAEZ-RODRIGUEZ, J.; HEIKAR, T. Sbml qualitative models: a model representation format and infrastructure to foster interactions between qualitative modelling formalisms and tools. BMC Systems Biology, v. 7, 2013.

37 PROJECT, Q. 2014. Disponível em: http://qt-project.org/. 38 GILLESPIE, D. T. Exact stocastic simulation of coupled chemical reactions. Journal of Physical Chemistry, v. 25, p. 2340–2361, 1977.

39 PETZOLD, L. Automatic selection of methods for solving stiff and nonstiff systems of ordinary differential equations. SIAM Journal on Scientific and Statistical Computing, v. 4, p. 136–148, 1980. 40 HINDARSH, A. C. Odepack, a systematized collection of ode solvers. IMACS Transactions on Scientific Computation, v. 1, p. 55–64, 1982.

41 WEISSTEIN, E. W. Adams’ Method. 2014. MathWorld – A Worlfram Web Resource. Disponível em: http://mathworld. wolfram.com/AdamsMethod.html.

42 SUNDIALS. 2007. Disponível em: http://sundials.wikidot. com/bdf-method.

43 REDER, C. Metabolic control theory: A structural approach. Journal of Theoretical Biology, v. 135, p. 175–201, 1988.

44 ANTON, H. Calculus with Analytic Geometry. [S.l.]: Wiley, 1999. 165–171, A44–A46 p.

45 IDA, Y.; HIRASAWA, T.; FURUSAWA, C. Utilization of

Saccharomyces cerevisiaerecombinant strain incapable of both ethanol

and glycerol biosynthesis for anaerobic bioproduction. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 97, p. 4811–4819, 2013. 46 XIAOJING, X.; LIMIN, C.; XUN, C. Elementary flux mode analysis for optimized ethanol yield in anaerobic fermentation of glucose with Saccharomyces cerevisiae. Chinese Journal of

88

Chemical Engineering, v. 16, p. 135–142, 2008.

47 ZANGHELLINI, J.; RUCKERBAUER, D. e.; HANSCHO, M.; JUNGREUTHMAYER, C. Elementary flux modes in a nutshell: Properties, calculation and applications. Biotechnology Journal, v. 8, p. 1009–1016, 2013.

48 SCHUSTER, S.; DANDEKAR, T.; FELL, D. Description of the algorithm for computing elementary flux modes. 2014. Disponível em: http://pinguin.biologie.uni-jena.de/ bioinformatik/networks/metatool/algorithm.pdf.

49 UNIPROT. P17709 – HXKG YEAST. 2014. Disponível em: http://www.uniprot.org/uniprot/P17709.

50 UNIPROT. P04807 – HXKB YEAST. 2014. Disponível em: http://www.uniprot.org/uniprot/P04807.

51 UNIPROT. P04806 – HXKA YEAST. 2014. Disponível em: http://www.uniprot.org/uniprot/P04806.

52 STAMBUK, B. U.; BATISTA, A. S.; ARAúJO, P. S. de. Kinetics of active sucrose transport in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 89, p. 212–214, 2000.