Inhibition des enzymes impliquées dans la régulation de l’hypertension artérielle

2.1.1. Mesure de l’inhibition de l’activité de l’enzyme de conversion

de l’angiotensine (ECA) en utilisant 3 types de substrats

Une étude comparative du pouvoir inhibiteur de 11 cryptides marins déterminé par 3 méthodes a été entreprise. Le pouvoir inhibiteur est exprimé en CI 50. Les valeurs de CI 50, définies comme étant la concentration en inhibiteur nécessaire pour réduire soit l'aire du pic de produit soit l’activité de l’enzyme de 50%, ont été déterminées et comparées. Le captopril a été choisi comme inhibiteur de référence (contrôle positif) et le losartan comme contrôle négatif.

2.1.1.1. Mesure de l’inhibition de l’activité de l’ECA en utilisant le FAPGG comme substrat

Le Z-furanacryloyl-L-phenylalanylglycylglycine (FAPGG) est hydrolysé sous l’action de l’enzyme de conversion de l’angiotensine en furanacryloyl L-phenylalanine (FAP) et GlycylGlycine (GG). La dégradation du FAPGG est suivie spectrophotométriquement à une longueur d’onde de 340 nm (figure 15).

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Figure 15 : Dégradation du FAPGG par l’enzyme de conversion de l’angiotensine. Libération du FAP et GG.

Le test a été réalisé en microplaque 96 puits selon la méthode décrite par Cushman et al. (1977) avec des modifications : 150 µl de FAPGG (0,87 mM) dans du tampon 50 mM Tris HCl contenant 300 mM NaCl, pH 7 ont été mélangés avec 10 µl de ce même tampon et 10 µl de la solution d'inhibiteur (captopril, losartan ou cryptides). Le mélange a été incubé à 37°C pendant 5 min. La réaction a été initiée par l'addition de 10 µL d’ECA (127,5 mU/ml). La plaque a été agitée 20 s avant la première lecture, et la dégradation du FAPGG a été suivie à 340 nm pendant 5 min avec le spectrophotomètre Max Molecular Devices Versa. Le pourcentage d'inhibition de l'ECA a été calculé selon l'équation suivante :

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Equation 1 : Calcul du pourcentage d’inhibition de l’ECA par la méthode utilisant le FAPGG.

Où «pente test» et «pente contrôle» sont les pentes des courbes de dégradation du FAPGG en fonction du temps des réactions avec l’inhibiteur ou contrôle.

2.1.1.2. Mesure de l’inhibition de l’activité de l’ECA en utilisant le HHL comme substrat

Cette méthode de Cushman et Cheung (1971) est la plus ancienne et la plus utilisée pour le dosage de l’activité de l’ECA. Elle est basée sur l’utilisation du peptide His-Leu couplé à l’acide hippurique, le HHL (Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine), substrat synthétique de l’ECA. L’hydrolyse du HHL par l’enzyme de conversion de l’angiotensine libère de l’acide hippurique (AH) et un dipeptide l’Histidyl-Leucine selon la réaction présentée dans la figure 16.

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Figure 16 : Dégradation de l’Hippuryl-Histidyl-Leucine (HHL) par l’enzyme de conversion de l’angiotensine et libération du dipeptide Histidyl-Leucine et de l’acide hippurique (AH). L’absorbance à la longueur d’onde d’absorption maximale de l’acide hippurique, soit 228 nm, permet de suivre la production de HA. Le test a été réalisé en microplaque selon la méthode précédemment décrite par Wu et al. (2002) avec des modifications : 30 µl d’ECA (60 mU/ ml) dans 50 mM de tampon borate, contenant 300 mM NaCl, pH 8,3 ont été mélangés avec 20 µl du même tampon et incubés pendant 5 min à 37 °C.

10 µl de la solution d'inhibiteur (captopril, losartan, ou cryptides) à différentes concentrations (0.001-2000 µM) ont été ajoutés, et la réaction a été initiée par l'addition de 50 µl de HHL (5 mM) préalablement solubilisé dans le même tampon. Après une incubation de 30 min à 37°C, la réaction a été stoppée par ajout de 100 μl d’HCL (1M).

La séparation et la quantification de l’HA a été réalisé par HPLC analytique (Waters, Milford, États-Unis) sur une colonne C18 (Kinetex 2,6 μm, 100 mm × 4,6 mm Phenomenex (Le Pecq, France). L’élution a été conduite en mode isocratique : eau ultra-pure+0,1% acide trifluoroacétique (TFA) et acétonitrile + 0,1% TFA avec un débit de 0,5 ml/min pendant 6 min. Un écart de 5 min était respecté entre deux injections. Les temps de rétention du HHL et du HA étaient respectivement de 2,27 et de 1,57 min. L'inhibition de l'ECA (en pourcentage) a été calculée selon l'équation 2 :

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Equation 2 : Calcul du pourcentage d’inhibition de l’ECA par la méthode HHL.

Où A test et A contrôle sont respectivement, les aires du pic du HA dans l’échantillon test (avec l’inhibiteur) et l'échantillon contrôle (tampon au lieu de l’inhibiteur).

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2.2.1.3. Mesure de l’inhibition de l’activité d’ECA en utilisant l’angiotensine I comme substrat

L’angiotensine I (Ang I) est le substrat naturel de l’enzyme de conversion de l’angiotensine qui le dégrade en angiotensine II (Ang II) par clivage du dipeptide His-Leu en C-terminal (figure 17).

Figure 17 : Dégradation de l’angiotensine I en angiotensine II par l’ECA.

Le test a été réalisé en microplaque 96 puits. 20 µl de tampon borate de sodium 50 mM, contenant 300 mM de NaCl, à pH 8,3 ont été pré-incubés à 37°C pendant 5 min. Par la suite, 30 µl d’ECA (127,5 mU/ml) dans le même tampon d'essai, 10 µl de la solution d’inhibiteur (captopril, losartan, ou peptide) à différentes concentrations (0.001-2000 µM) et 20 µl de l'angiotensine I (5 mM) ont été ajoutés séquentiellement afin d’initier la réaction. La microplaque a été incubée à 37°C pendant 30 min.

La réaction a été arrêtée par addition de 100 µl de HCl 1M. L'angiotensine II libérée par l’action de l’ECA a été quantifiée par HPLC sur le système décrit précédemment pour le test HHL. Un gradient d'acétonitrile contenant 0,1% de TFA de 25 à 50% en 7 min, suivi par 1 min. à 50% puis retour à 25% en 2 min a été utilisé. Les temps de rétention sont de 1,68 et 2,45 min pour l’angiotensine I et l'angiotensine II, respectivement. Les aires des pics ont permis de quantifier l'angiotensine II.

Le pourcentage d'inhibition de l'ECA a été calculé selon l’équation 3:

Equation 3 : Calcul du pourcentage d’inhibition de l’ECA utilisant l’angiotensine I comme substrat. Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe His-Leu Ang II Ang I ECA

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Où A test et A contrôle sont respectivement les aires du pic de l’angiotensine II dans l’échantillon test (avec l’inhibiteur) et l'échantillon contrôle (tampon au lieu de l’inhibiteur).

2.1.2. Mesure de l’inhibition de l’activité de la cathepsine G

La cathepsine G est capable de générer de l’angiotensine II (Ang II) par clivage du dipeptide en C-terminal His-Leu de l’angiotensine I (Ang I). La chymostatine, un puissant inhibiteur de la cathepsine G a été utilisée comme référence.

Le test a été réalisé en microplaque selon la méthode précédemment décrite par Klickstein et al. (1982) avec des modifications : 20 µl de cathepsine G (60 mU/ml) dans 10 mM de tampon Tris-HCL, NaCl 150 mM, pH 7,4 ont été mélangés avec 40 µl du même tampon et 10 µl de la solution d'inhibiteur (Chymostatin, ou cryptides) à différentes concentrations (0.001-2000 µM) et incubé pendant 5 min à 37 °C.La réaction a été initiée avec l'addition de 30 µl d’Ang I (0,66 mM). Après une incubation de 30 min à 37°C, la réaction a été stoppée par ajout de 100 μl de HCL (1 M). La quantification de l’Ang II formée été réalisée selon la méthode décrite dans la partie 2.1.1 (Mesure de l’inhibition de l’activité d’ECA en utilisant l’angiotensine I comme substrat). La quantification de l’Ang II formée ainsi que le pourcentage d'inhibition de l'ECA a été calculé selon l’équation 3.

2.1.3. Mesure de l’inhibition de l’activité de la chymase

La chymase est capable de générer de l’Ang II par clivage du dipeptide C-terminal His-Leu de l’Ang I. La chymostatine, un puissant inhibiteur de la chymase a été utilisé comme référence. Le test a été réalisé en microplaque selon la méthode précédemment décrite par Li et al. (2004) avec des modifications : 5 µl de chymase (185,2 mU /ml) dans 20 mM de tampon Tris HCL, NaCl 150 mM, pH 7,8 ont été mélangés avec 40 µl du même tampon et 10 µl de la solution d'inhibiteur (chymostatine, ou peptide) à différentes concentrations (0,001-2000 µM) et incubés pendant 5 min à 37 ° C. La réaction a été initiée avec l'addition de 20 µl d’Ang I (0,5 mM). Après une incubation de 30 min à 37°C, la réaction a été stoppée par ajout de 50 μl de HCL (1 M). La quantification de l’Ang II formée été réalisée selon la méthode décrite dans la partie 2.1.1 (Mesure de l’inhibition de l’activité d’ECA en utilisant l’angiotensine I comme substrat). Le pourcentage d'inhibition de l'ECA a été calculé selon l’équation 3.

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