Inhibition chimique de l’activation de la voie STAT3

En réponse à l’infection par E.coli, nous avons détecté une faible activation de la voie Stat3 chez les souris invalidées pour le gène Il6. L’expression de l’hepcidine est également altérée chez ces souris, suggérant que c’est l’activation résiduelle de la voie Stat3 qui est à l’origine de la faible augmentation de l’hepcidine observée chez ces souris.

Nous nous sommes alors questionné sur l’expression de l’hepcidine en cas d’inhibition totale de l’activation de la voie STAT3. Pour répondre à cette question, nous avons choisi d’utiliser un inhibiteur de la phosphorylation de STAT3 (Stattic). Le Stattic inhibe la fonction du domaine SH2 de STAT3, et empêche sa phosphorylation, son activation, sa dimérisation et donc sa translocation dans le noyau [235].

Inhibition de l’activation de la voie de signalisation STAT3 in vitro

◦ Nous avons tout d’abord validé l’effet du Stattic in vitro, sur une lignée d’hépatomes humains (HepG2) en présence d’IL6.

Comme décrit dans la littérature, la stimulation par l’IL6 pendant 1h induit la phosphorylation de STAT3 dans ces cellules, ainsi que l’expression de l’hepcidine [37, 38, 109-111, 112 , 113, 114]. Nous avons également quantifié l’expression de SOCS3, cible transcriptionnelle directe de la voie STAT3, dans les cellules et nous avons observé une forte induction de ce gène en réponse au traitement par l’IL6 (Figure 25A).

L’ajout de l’inhibiteur Stattic inhibe la phosphorylation de STAT3 ainsi que l’expression de SOCS3 (Figure 25A). En réponse à l’IL6, l’induction totale de l’hepcidine par l’IL6 est également inhibée par le Stattic, même si une légère induction est tout de même visible, peut-être due à la demi-vie de l’ARNm de l’hepcidine (Figure 25B). Nous avons donc validé l’action du Stattic in vitro et montré l’importance de l’activation de la voie STAT3 pour l’induction de l’hepcidine par l’IL6.

109

Figure 25. Effet du Stattic sur la voie de signalisation STAT3 et l’expression de l’hepcidine dans des lignées d’hépatomes humains HepG2 prétraités à l’IL6.

(A) L’expression de SOCS3 selon le traitement a été évaluée par PCRq et l’état d’activation de la voie STAT3 a

été quantifiée par la détection de la forme phosphorylée de STAT3 par WB. (B) L’expression de HAMP selon le traitement a été évaluée par PCRq. Les valeurs montrées sont des moyennes ± ET. Les effets des différentes stimulations ont été évalués par un test ANOVA à un facteur, suivi d’une comparaison des moyennes (test de Tukey). **** : p<0.0001.

Inhibition de l’activation de la voie de signalisation Stat3 in vivo

◦ Nous avons ensuite testé différents protocoles pour utiliser le Stattic in vivo afin d’inhiber totalement l’activation de la voie Stat3 lors d’une inflammation chez la souris. Nous avons choisi d’utiliser le modèle d’inflammation induit par le LPS comme activateur de la voie Stat3 pour mettre au point notre protocole.

Des souris CD1 ont soit été pré-piquées avec l’inhibiteur avant la stimulation au LPS, soit piquées avec l’inhibiteur en même temps que la stimulation avec le LPS, puis leur foie a été prélevé après 1 heure de stimulation (temps où l’activation de Stat3 est maximale dans l’hépatocyte) et 4h (temps où l’induction de Hamp est maximale dans le foie). Nos premiers résultats n’ont montré aucun effet du Stattic puisqu’en réponse au LPS, la voie Stat3 est toujours activée à 1h, même en présence de l’inhibiteur (résultats non montrés). De même, l’expression de Socs3, à 1h, et de l’hepcidine, à 4h, n’est pas altérée par l’injection du Stattic dans le foie des souris. L’inefficacité de l’inhibiteur in vivo étant peut-être due aux fortes doses de LPS utilisées (1µg de LPS par g de souris), nous avons utilisé par la suite des doses de LPS plus faibles (0,01 ; 0,05 et 0,1 µg total de LPS chez la souris). Pour optimiser l’effet du Stattic, les souris ont reçu deux injections de l’inhibiteur : une injection 1h avant celle du LPS et une injection en même temps que le LPS, aux doses maximales décrites dans la littérature [236-238].

Aucun de ces protocoles n’a permis une inhibition, même partielle, de l’activation de Stat3 dans le foie, en réponse au LPS.

C^tl C^tl + ^D M^S O _Il6 Il⁶ + ^D M^S O ² 5^M Il⁶ + ^S ta^tt ic ² 5^M - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2 0 2 S o c s 3 * * * * * * * * C^tl C^tl + ^D M^S O _Il6 Il⁶ + ^D M^S O ² 5^M Il⁶ + ^S ta^tt ic ² 5^M - 1 0 1 2 H a m p * * * * _{* * * *} -d C t (H P R T H A M P ) A _B

Ctl IL6 _DMSO^IL6 _{Stattic 25}^IL6

P-Stat3 Stat3

110 Conclusion

Nous n’avons donc pas pu déterminer l’impact d’une inhibition totale de l’activation de la voie Stat3 in vivo sur l’expression d’Hamp. Nous sommes actuellement en train de réaliser des expériences sur des souris invalidées pour le gène Stat3 dans les hépatocytes, afin de déterminer si cette voie est réellement impliquée dans la régulation d’Hamp, ou si une autre voie de signalisation est impliquée.

Néanmoins, au vu des études de la littérature, l’inhibition totale de l’activation de STAT3 devrait conduire à une altération complète de l’expression de l’hepcidine en réponse à l’inflammation [126, 137]. En effet, des souris invalidées pour Stat3 ou Gp130 dans l’hépatocyte n’augmentent plus leur hepcidine en réponse à la térébenthine ou à l’Il6, respectivement. Ces modèles ne sont pas infectieux, et, on l’a vu, il y a des différences majeures entre notre modèle LPS et notre modèle E.coli. Il est donc important d’évaluer l’expression de l’hepcidine chez ces souris en réponse à une infection bactérienne pour conclure sur le rôle de la voie Stat3.

Si ce résultat est confirmé dans notre modèle bactérien, cela signifie que la voie Stat3 est bien impliquée dans la régulation de Hamp. Cependant, l’absence totale de corrélation entre la cinétique de Hamp et celle de Socs3, cible directe de Stat3, suggère une action probablement indirecte de Stat3 sur l’hepcidine et l’existence d’une molécule intermédiaire.

111

IV. Implication de l’IL6 dans la régulation transcriptionnelle de la lipocaline-2