Influence de la quantité et la nature de la lipase

Pour l’étude de ce paramètre nous avons choisi quatre lipases commerciales : la lipase de

Candida cylindracea (CCL ; activité spécifique = 3,85 U/mg), la lipase de Candida rugosa

(CRL ; 1170 U/mg), la lipase de Psedomonas cepacea (PCL ; > 30,000 U/mg) et la lipase de

Candida antarctica (CAL-B ; > 10,000 U/mg). Nous avons examiné la quantité catalytique

optimale, le temps de la réaction et la température dans le but de parvenir aux conditions adéquates.

Nous avons étudié en particulier, la source d’eau responsable de l’hydrolyse ; Pour cela, et dans un premier temps le toluène utilisé est mis sur tamis moléculaire.

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(a) N. Bouzemi, H. Debbeche, L. Aribi-Zouioueche, J_C. Fiaud ; Tetrahedron Letters, 2004, 45, 627-630. (b) N. Bouzemi, L. Aribi-Zouioueche, J_C. Fiaud ; Tetrahedron: Asymmetry, 2006, 17, 797-800. (c) M. Merabet, N. Melaïs, M. Boukachabia, J-C. Fiaud, L. Aribi-Zouioueche ; J. Soc. Alg. Chim, 2007, 17, 185-194. (d) M. Merabet-Khelassi, N. Bouzemi, O. Riant, L. Aribi-Zouioueche ; C. R. Chimie, 2011, 14, 978-986.

La réaction est effectuée sur une milli mole d’acétate racémique avec une milli mole de carbonate de sodium dans 3ml de toluène avec la lipase. Des réactions témoins sont mise en

œuvre pour examiner le rôle de la lipase et de Na2CO3 ; Le premier témoin à blanc, est une

réaction en l’absence de lipase et de Na2CO3, le second étant est la réaction avec Na2CO3

sans lipase.

Nous avons ensuite étudié la réaction avec la CAL-B sans Na2CO3, puis examiné le taux

catalytique optimal. D’autres lipases ont été mises en œuvre dans cette réaction.

Après 72h de réaction, le mélange acétate résiduel / alcool formé est récupéré. Les excès énantiomériques (ee) sont déterminés par chromatographie chirale (CPG) ou HPLC et les résultats sont résumés dans le tableau 6.

Tableau 6 : Influence de la quantité et la nature de la lipase sur l’hydrolyse de l’acétate 7a

Entréea Lipase (mg) Temps (h) Ees (%)i

(S) Eep (%)i (R) C (%)j Ej 1 -b 72 - - - - 2 -c 72 - - - - 3 CAL-Bd,e(40) 72 9,5 99,5 9 >200 4 CAL-Be (40) 72 67 99,5 40 >500 5 CAL-Be,g (40) 48 86 99,5 46 >500 6 CAL-Bf (50) 72 49 99,5 33 >500 7 CAL-Bf (100) 72 70 99,5 41 >500 8 CAL-Bf,h (100) 72 99 99,5 50 >500 9 CCL (100) 6 jours 0,4 7 5 1 10 CRL (100) 6 jours 0,4 12,4 3 1 11 PCL (100) 6 jours 6,4 99,5 6 >500 a

les Conditions de la réaction : 1mmol de l’acétate racémique, 1mmol de Na2CO3 dans 3 ml de toluène en de

présence de diverses lipases à une température ambiante.

b

réaction se fait sans la lipase et sans Na2CO3, c la réaction se fait sans lipase et en présence de Na2CO3 d

la réaction en présence de lipase et en l’absence de Na2CO3 e

CAL-B est de la firme d’Aldrich, l’activité spécifique est >10,000 U/ mg

f

CAL-B est de la firme de Sigma, l’activité spécifique est >10,000 U/ mg

g

l’éther diéthylique (Et2O) comme solvant organique, h à 40°C, i Calculé avec la GC chirale j

On constate que la CAL-B est la seule lipase active et sélective, qui nous a permis d’obtenir des sélectivités élevées (E>500) et de bonnes conversions (33%< C <40%) (entrées 4 et 6). Après 6 jours d’agitation, les lipases CCL et CGL montrent de faibles réactivités et sélectivités C<5% et E=1 (entrées 9 et 10). La PCL est aussi peu réactive mais montre une sélectivité E>500 (entrée 11).

L’analyse de ce tableau montre qu’il n’y a pas d’hydrolyse en l’absence de la CAL-B et du

carbonate de sodium (entrée 1). En présence d’un équivalent de Na2CO3 et en l’absence de la

lipase, aucune réaction d’hydrolyse n’a été observée non plus (entrée 2).

La présence de la CAL-B sans Na2CO3 conduit à une hydrolyse de l’acétate avec un faible

avancement (C=9%, E>200) après 72 heures (entrée 3).

L’utilisation de la lipase CAL-B avec le carbonate de sodium dans la réaction permet d’augmenter l’avancement de la réaction à C=40% et la sélectivité, E>500 (entrée 4). La

présence de Na2CO3 influe directement et de manière significative sur la réactivité de la

lipase.

L’augmentation de la quantité de la lipase à 100 mg montre le même avancement de la réaction d’hydrolyse enzymatique (C = 41%) avec le maintien de la sélectivité (E>500) (entrée 7).

Lorsque la température est augmentée jusqu'à 40°C, nous obtenons les deux énantiomères, à savoir, l’acétate résiduel et l’alcool formé de la réaction optiquement purs, ee > 99,5%, à une conversion de 50%, E>500 (entrée 8). Le remplacement du toluène comme solvant de réaction par un solvant hydrophobe, le diéthyléther donne une conversion de (C = 46%) avec sélectivité (E>500) (entrée 5).

En conclusion, l’utilisation des solvants hydrophobes tels que le toluène et l’éther diéthylique permet de dire que l’eau impliquée dans le processus d’hydrolyse de ces acétates benzyliques secondaires est probablement l’eau (native) de la lipase.

Le même phénomène a été observé par Fülöp et coll174 qui ont noté que l’hydrolyse des acétates se fait sans l’ajout d’eau. L’hydrolyse est attribuée à l’eau présente dans la préparation de la lipase de Burkholderia cepacea ou dans le solvant utilisé.

Parmi les lipases que nous avons utilisées, la CAL-B est la seule qui donne des sélectivités (E>500) et des conversions élevées (C>33%).

Nous avons optimisé les conditions réactionnelles de l’hydrolyse enzymatique en milieu organique en présence d’une base avec l’acétate du 1-phényléthanol. Pour valider ce protocole nous l’avons appliqué à une série d’acétates secondaires (schéma110).

Les acétates benzyliques secondaires 1a--9a sont hydrolysés selon le nouveau protocole sur une milli mole de substrat dans 3ml de toluène en présence d’une quantité variable de

Na2CO3 et de la lipase CAL-B en quantités (m1= 50mg) et (m2=100mg) pour chaque substrat

à température égale à 40°C pendant 72 heures.

Après les 72 heures de réaction, les acétates résiduels et des alcools formés sont récupérés après filtration de la lipase et ils sont séparés par chromatographie sur colonne de gel de silice. Les excès énantiomériques (ee) sont déterminés par GC ou HPLC sur colonne chirale.

OAc 2 (+/-)-1a: n = 1 (+/-)-2a: n = 2 OAc R (+/-)-3a: R= OMe (+/-)-4a: R = H OAc (+/-): 5a OAc R (+/-)-7a: R= H (+/-)-8a: R = OMe (+/-)-9a: R = OEt OAc (+/-): 6a

Schéma 108: Dédoublement cinétique des acétates racémiques 1a-9a par hydrolyse enzymatique dans le toluène en présence du carbonate de sodium

Les résultats de cette étude sont rassemblés dans le tableau 7.

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Tableau 7 : Hydrolyse enzymatique des acétates racémique 1a-9a dans le toluène

Entréa Substrat CAL-B

(mg) ees(%)b rdt(%)c (S)e eep(%)b rdt(%)c (R)g Cd(%) Ed 1 1a 100 95 35 99.5 30 49 >500 50 98.2 36 99 32 50 >500 2 2a 100 78 46 99.5 35 44 >500 50 99.5 48 99.5 48 50 >500 3 3a 100 99 32 99.5 34 50 >500 50 93 29 96.3 30 49 >500 4 4a 100 95 47 99.5 45 49 >500 50 98 48 98.6 48 50 >500 5 5a 100 - - - - - - 50 90.3 35 98.2 27 48 >300 6 6a 100 - - - - - - 50 99 - 99 - 50 >200 7 8a 100 95 47 97 46 49 >300 50 96 48 97 48 50 >200 8 9a 100 92 45 95.6 40 49 150 50 95 42 97.6 35 49 >300 a

Réaction réalisée avec 1mmol d’acétate racémique, 1mmol de Na2CO3 dans 3 ml de toluène à 40°C en

présence du CAL-B pendant 72 heures. bCalculé par la GC ou HPLC. c Rendements chimiques isolés g

Configuration absolue déterminée par la comparaison entre le pouvoir rotatoire du produit isolé et la littérature (partie expérimentale)

L’examen du tableau 7 fait apparaitre l’ensemble des substrats dédoublés avec la lipase CAL-

B, les sélectivités élevées E>150 et les conversions maximales C>49%.

En présence de 100 mg de CAL-B, les acétates racémiques sont dédoublés avec de bonnes conversions et d’excellentes sélectivités (E>500) pour les différentes structures. La diminution de la quantité d’enzyme jusqu’à 50 mg n’entraîne aucune influence sur l’hydrolyse, les sélectivités et réactivités étant analogues. On constate que la CAL-B conserve une énantiopréférence pour la configuration (R). La quantité optimale de lipase est égale à 50 mg.

Suite à cela, nous nous sommes intéressés au rôle du carbonate de sodium dans le système biocatalytique et son influence sur la sélectivité enzymatique.

Dans un premier temps, nous avons étudié l’effet de la quantité de Na2CO3 et celui de la

nature de l’ion carbonate. Pour cela, nous avons modifié la quantité de Na2CO3 mise en jeu

dans la réaction et nous avons modifié la nature de l’ion carbonate ; Nous avons substitué l’ion sodium Na+ par l’ion potassium K+ et l’ion calcium Ca2+.