Influence de la quantité de NaBz et de la présence d’HPβCD

Une étude antérieure du laboratoire avait montré que des films à base de PVOH chargés en NaBz et réticulés par le GA (qui ne porte pas de fonction COOH et qui une fois réagi n’a pas d’effet antimicrobien) avaient une activité contre S. aureus (Figure VIII.IV. 1). Nous avons donc montré la bioactivité du NaBz dans la matrice PVOH.

Figure VIII.IV. 1. Test Kirby-Bauer pour des films PVOH réticulés par du glutaraldéhyde et contenant du NaBz sur la bactérie S. aureus

Pour notre étude, à taux de CTR constant (20 wt%), nous avons fait varier la quantité en NaBz et étudié l’influence de la présence ou non du complexe [HPβCD : NaBz] ainsi que de la structure du réseau (au travers du temps de réticulation). Les tests de libération dans l’eau ayant montré que l’augmentation de NaBz incorporé dans les films menait à une quantité libérée supérieure, des films à taux de NaBz croissant (0, 3 et 6 wt% de NaBz) ont été réalisés. Dans le cas des films avec HPβCD, il n’est pas possible d’incorporer 6 wt% de NaBz sous forme de complexe 1 : 1 car la proportion en HPβCD nécessaire est trop importante (60 wt%). Pour ces films un mélange [HPβCD : NaBz] 1:2 (avec une part de NaBz inclus dans les cavités et l’autre part en excès), préparé suivant le même protocole que pour le complexe (Chapitre V - III), est incorporé. Les résultats obtenus pour ces films vis-à-vis de la bactérie S. aureus sont présentés sur la Figure VIII.IV. 2.

Figure VIII.IV. 2. Tests Kirby-Bauer en masse sur S.aureus pour des films réticulés avec 20 wt% de CTR (40 ou 360 min) pour des quantités variables en NaBz avec 30 wt% ou sans HPβCD

Pour l’ensemble des films, on peut observer l’apparition d’un cercle d’inhibition, ils montrent tous une activité contre S. aureus y compris ceux sans NaBz.

IV.2.1.1 Cas des films sans HPβCD

Les résultats quantitatifs des films sans HPβCD pour les 4 microorganismes étudiés sont présentés Figure VIII.IV. 3. Le trait noir correspond au diamètre initial des films (11 mm). Les films ayant un diamètre d’inhibition égal à 11 mm ont ainsi une activité uniquement par contact alors que les films ayant un diamètre supérieur ont une activité à la fois par contact et par diffusion.

Figure VIII.IV. 3. Diagramme des diamètres d’inhibition de films à 20 wt% CTR sans HPβCD en fonction de trét (40 et 360 min) et de la quantité de NaBz contre 4 espèces microbiennes

On peut tout d’abord remarquer deux groupes distincts de microorganismes du point de vue de l’inhibition : les bactéries d’une part et les champignons (levure et moisissure) d’autre part. A taux de CTR constant (ici 20 wt%) :

 Pour les deux bactéries, le diamètre d’inhibition diminue quand trét augmente, avec ou sans NaBz. L’impact du NaBz n’est pas flagrant. En effet, les films non chargés ont déjà une activité. Etant donné la CMI du CTR (2 et 4 g/L pour S. Aureus et E. coli respectivement) comparée à celle du NaBz (25 g/L pour les deux), on en déduit que l’activité des films est surtout due au contact avec le CTR lié et à la diffusion du CTR libre. Notons que cette activité est plus importante pour un trét de 40 min, due au CTR libre mis en évidence préalablement (cf. RMN du Chapitre VII - III). Toutefois, une légère augmentation du diamètre d’inhibition est observée pour 6 wt% de NaBz, probablement liée à la diffusion plus importante de NaBz.

 Pour les champignons, les tendances sont moins évidentes. Seuls les films avec

6 wt% de NaBz semblent présenter une activité par diffusion. Pour les autres formulations, l’activité est seulement par contact. Ce résultat est probablement dû à une

activité par diffusion du NaBz contre ces deux microorganismes. Notons toutefois que contre Aspergillus niger, le film avec 6 wt% de NaBz réticulé 360 min ne montre pas d’activité par diffusion (contrairement aux autres microorganismes) et que le même film sans NaBz ne montre aucune activité même par contact.

IV.2.1.2 Cas des films avec HPβCD

L’influence de l’HPβCD est maintenant étudiée à travers les résultats quantitatifs de films avec

des proportions croissantes en NaBz, cette fois sous forme de complexe vis-à-vis des quatre microorganismes (Figure VIII.IV. 4).

Figure VIII.IV. 4. Diagramme des diamètres d’inhibition de films à 20 wt% CTR avec HPβCD en fonction de trét (40 et 360 min), de la quantité de NaBz contre 4 espèces microbiennes

Dans ce cas, une différence d’activité en fonction de la nature des microorganismes est beaucoup moins flagrante. Aspergillus niger se distingue légèrement des trois autres microorganismes mais on peut néanmoins dégager des tendances. En effet, de manière générale :

 Quel que soit le microorganisme, le diamètre d’inhibition est souvent supérieur à 11 mm, ce qui montre une activité par diffusion plus présente que pour les films sans HPβCD.

 Cette activité par diffusion diminue quand le temps de réticulation augmente mais de manière moins importante que pour les films sans HPβCD.

 La présence de NaBz a peu d’influence sur l’activité antimicrobienne pour les temps faibles de réticulation (40 min), sauf pour Aspergillus niger. Pour les longs temps de réticulation (360 min), la présence de NaBz permet d’améliorer l’activité antimicrobienne pour les bactéries et Candida.

 La présence d’HPβCD améliore uniquement l’activité des films avec 3 wt% de NaBz par

rapport à ceux sans HPβCD. Le fait qu’elle ne permette pas d’améliorer l’activité des films avec 6 wt% de NaBz est un résultat surprenant qui reste à approfondir. Pour les tests contre Candida, les films non chargés ont un diamètre d’inhibition plus grand en présence d’HPβCD. Etant donné l’absence de NaBz dans ces films, il est intéressant d’envisager que la présence d’HPβCD joue également un rôle dans la diffusion du CTR libre.

Du point de vue des microorganismes, les mécanismes d’inhibition sont différents. En effet,

les résultats montrent que les microorganismes n’ont pas la même sensibilité aux différents films. Aspergillus niger semble surtout sensible à la diffusion de NaBz. Candida semble surtout sensible à NaBz mais la diffusion du CTR permet également de l’inhiber. Quant aux bactéries (S. aureus et E. coli), elles sont sensibles à NaBz et CTR mais l’activité des films est surtout liée à la libération du CTR. L’activité des films est plus grande pour 40 min de réticulation, surtout pour Aspergillus niger.

Pour conclure, avec HPβCD, l’activité par diffusion est améliorée. Il semblerait donc que le réseau macromoléculaire en présence d’HPβCD possède une structure différente et peut-être plus lâche permettant de libérer le CTR non lié et le NaBz.

IV.2.1.3 Etude ponctuelle sur les films contenant 10 wt% de NaBz

Sans HPβCD, l’augmentation de la proportion de NaBz ayant montré une légère amélioration sur l’activité des films, une étude ponctuelle sur les quatre microorganismes pour des films chargés avec 10 wt% de NaBz a été réalisée. Le but est d’observer si une plus forte augmentation de la quantité de NaBz améliore l’activité des films. A titre de comparaison, des films avec ou sans HPβCD sont réalisés. Dans ce cas, 10 wt% de NaBz sont ajoutés sous forme de mélange avec 10 wt% d’HPβCD. Le mélange [HPβCD : NaBz] 1:10 est préparé suivant le même protocole que pour le complexe [HPβCD : NaBz] 1:1 (Chapitre V - III). A titre d’exemple, les résultats de diamètre d’inhibition obtenus pour les films réticulés 40 min avec 10 wt% de NaBz avec HPβCD contre S. aureus, E. coli et Candida sont présentés sur la Figure VIII.IV. 5. On observe bien un cercle d’inhibition pour ces trois microorganismes.

Figure VIII.IV. 5. Tests Kirby-Bauer en masse sur S. aureus, E. coli et Candida pour des films PVOH/[HPβCD-NaBz]/CTR-60/[10-10]/20 réticulés 40 min

Les films à 10 wt% de NaBz ont été comparés avec ceux à 6 wt% de NaBz. Les résultats quantitatifs pour les quatre microorganismes étudiés sont présentés Figure VIII.IV. 6.

Figure VIII.IV. 6. Diagramme des diamètres d’inhibition de films à 20 wt% en CTR avec ou sans HPβCD en

fonction de trét (40 et 360 min) contre les 4 microorganismes : Comparaison entre 6 et 10 wt% NaBz

Pour l’ensemble des microorganismes, les résultats obtenus pour les deux compositions de film sont similaires. Comme vu précédemment, de façon générale, seul le trét diminue l’activité des films pour les quatre microorganismes. L’augmentation de la quantité de NaBz, avec 10 wt% ou

sans HPβCD, ne permet pas d’augmenter le diamètre d’inhibition. Ces résultats indiquent donc une activité antimicrobienne majoritairement due au CTR.

On constate donc que l’ensemble des films a une activité antibactérienne et antifongique, au minimum par contact. Les meilleurs candidats pour une activité antimicrobienne sur gélose sur l’ensemble des microorganismes sont les films de composition suivante :

 Sans HPβCD : avec 6 wt% de NaBz

 Avec HPβCD : dans la fourchette 3 à 10 wt% de NaBz

La présence d’HPβCD permet une amélioration de l’activité dès 3 wt% de NaBz. Pour l’ensemble des films, la meilleure activité est obtenue pour un temps de réticulation de 40 min.

Il est difficile de corréler les résultats antimicrobiens avec la libération dans l’eau car, contrairement à la libération qui ne suit que le NaBz, l’activité antimicrobienne est également due aux COOH libres du CTR. Nous avons donc voulu mesurer l’impact de la quantité de COOH sur l’activité antimicrobienne.