d’irradiation UV et prétraitements du capillaire sur la réaction de polymérisation
4. Influence du prétraitement du capillaire sur les caractéristiques séparatives et optimisation
4. 1. Conditions de prétraitement
Après avoir fait une synthèse des principales méthodes employées et des résultats obtenus, plusieurs facteurs nous semblent importants pour le prétraitement des capillaires.
● Le rinçage basique est dans tous les cas indispensable. Il permet de dissoudre partiellement le réseau de silice et donc des sites silanol basiques plus facilement activables sous forme acide, car libérés de toute impuretés (cations métalliques ou alcalins). De plus, il semble que la température ait un effet sur cette étape.
● Le rinçage acide est nécessaire, puisque la réaction de silanisation a lieu avec les silanols sous forme acide (forme Si-OH). Cependant, elle peut être omise si la réaction de silanisation est conduite en milieu acide.
● Solvants, concentration en γ-MAPS et durée de la réaction sont variables d’une silanisation à une autre. Il ne se dégage pas d’avantage de certaines conditions par rapport à d’autres. Afin d’avoir plus d’information sur cette étape de prétraitement et sur son effet sur les propriétés des monolithes ainsi obtenus, nous avons étudié les réactions de silanisation. Celles-ci sont réalisées soit en milieu acide acétique à température ambiante (25°C), soit en milieu DMF à une température de 70°C. Deux rinçages basiques ont été envisagés soit à température ambiante pendant 30 minutes soit à une température de 90°C pendant 90 minutes. Les protocoles de ces quatre procédures, A à C sont décrits dans le Tableau 2.
Procédures de prétraitement Etape basique (NaOH 1M) Etape acide (HCl 0.1 M) Silanisation avec 3-TMSM
A 30 min, 25°C aucune Acide acetique15h 25 °C B 30 min, 25°C 30min, 25°C DMF 5h
70 °C C 90 min, 90°C aucune Acide acetique15h
25 °C DMF
Des capillaires d’environ 37 cm de longueur totale ont été prétraités (trois pour les protocoles A et B, deux pour les protocoles C et D) et la polymérisation de ceux-ci s’ensuit dans les 5 jours par remplissage avec le même mélange à polymériser dont le monomère fonctionnel est le butylacrylate (composition décrite en annexe 2). La polymérisation a lieu avec une énergie d’irradiation totale de 6 J/cm², puis la colonne ainsi obtenue est rincée, conditionnée sous champ électrique et partiellement sous pression par une phase mobile constituée d’un mélange d’ACN et de tampon phosphate 5 mM, pH=7.1, 80/20 (v/v). Finalement, les premières analyses test peuvent être effectuées pour l’évaluation des performances.
4. 2. Evaluation des performances (méthodologie)
4. 2. 1 Analyses électrochromatographiques
4. 2. 1. 1- Conditions séparatives
Le mélange test utilisé pour obtenir des courbes de van Deemter comporte 4 composés issus d’une même série d’alkylbenzènes linéaires : éthylbenzène, propylbenzène, butylbenzène et pentylbenzène. Ils sont injectés électrocinétiquement à 3kV pendant 3sec à la concentration de 2,5. 10-3 mol/L. La phase mobile utilisée pour la séparation présente la même composition que celle utilisée pour le rinçage du capillaire, soit un mélange d’ACN et de tampon phosphate 5 mM, pH=7,1, (80:20, v/v). Le marqueur de flux électroosmotique utilisé pour toutes les analyses est le formamide à la concentration de 10-2 mol/L. La Figure 32 représente un électrochromatogramme typique d’une séparation du mélange test utilisé pour le tracé des courbes de van Deemter. Les quatre composés tests sont séparés en moins de quatre minutes avec des efficacités comprises entre 250 et 300 000 plateaux/m.
Figure 32 : Electrochromatogramme du mélange test contenant les 4 alkylbenzènes effectués sur une colonne à base de butylacrylate l= 26,6 cm, ayant subi le protocole D ; longueur totale du capillaire : L= 35,1 cm, diamètre interne 100 µm. Tension : 30kV, electrolyte : ACN- tampon phosphate 5mM pH=7,1 (80 :20, v/v), détection à 200 nm. Avec (EOF) formamide, (1) éthylbenzène, (2) propylbenzène, (3) butylbenzène, (4) pentylbenzène.
min 1 2 3 4 5 mAU 0 5 10 15 20 25 30 EOF 1 2 3 4
4. 2. 1. 2- Courbes de van Deemter
Après quelques analyses permettant de vérifier la constance des performances analytiques de la colonne, le mélange test est analysé sous différentes tensions, donc à différentes vitesses électroosmotiques, afin d’établir une courbe de van Deemter. Trois répétitions des analyses sont effectuées pour chaque tension (5, 10, 15, 20, 25, 30 kV) permettant d’obtenir une bonne représentativité des résultats.
Tout d’abord, les couples de données (vitesse de la phase mobile – hauteur de plateau) obtenus pour chaque colonne issue d’un même prétraitement sont réunis en un même ensemble. Ensuite les coefficients de l’équation de van Deemter sont ajustés par l’utilisation de la fonction Excel Solveur du programme Microsoft Excel, et permettent d’obtenir une courbe ajustée. Cet accès aux coefficients d’une courbe permettra de comparer les divers prétraitements. Grâce aux valeurs de chacun des coefficients il sera aussi possible d’évaluer la contribution des origines de l’élargissement des pics ainsi que leur évolution en fonction des protocoles appliqués. Les valeurs des facteurs de rétention des composés tests pourront aussi être étudiées.
4. 2. 2 Images MEB
Après caractérisation électrochromatographique, des observations MEB et clichés de sections transversales de chaque colonne ont été réalisés par microscopie électronique à balayage. Les coupes transversales des colonnes sont réalisées en utilisant un coupe-capillaire. Celles-ci sont effectuées sur des matériaux préalablement séchés à l’air et nécessitent une métallisation préalable, toujours effectuée à l’or.
4. 3. Comparaison des méthodes de prétraitement par les images MEB
Les observations effectuées par microscopie électronique à balayage confirment une réticulation efficace entre le monolithe et la surface silanisée ainsi qu’une bonne homogénéité générale du polymère poreux pour l’ensemble des dix colonnes réalisées. La Figure 33 présente une image MEB représentative de chaque prétraitement. On peut voir que l’accrochage du monolithe aux parois du capillaire est meilleur pour les procédures C et D, ce qui semble indiquer qu’un traitement basique prolongé à chaud a un effet certain sur la structure du monolithe. En effet, des macropores et des nodules plus larges sont visibles sur
plus haute surface développée de la phase stationnaire ce qui doit ainsi fournir un meilleur accès à la phase stationnaire pour les solutés et la phase mobile et ainsi permettre un meilleur transfert de masse diffusif. Cela devrait réduire l’élargissement de la bande de soluté généré par une moindre résistance au transfert de masse vers la phase stationnaire et la diminution des effets de bords.
A C
B D
Figure 33 : Observations par microscopie électronique à balayage de colonnes monolithiques à base de butylacrylate dans des capillaires de silice vierge de 100 µm de diamètre interne. Chaque vue correspond à un des prétraitements testés : A, B, C, D.
4. 4. Comparaison des méthodes de prétraitement par les facteurs de rétention
Le facteur de rétention, k’, caractérise les interactions développées par le soluté entre la phase stationnaire et la phase mobile en fonction de leur nature et sans tenir compte de paramètres géométriques de la colonne. k’ = K. Vs/Vm avec Vs le volume de phase stationnaire et Vm le volume de phase mobile et k la constante de distribution du soluté entre les deux phases. Etant donné que toutes les colonnes ont été synthétisées à partir du même mélange de monomères, les groupements fonctionnels développés par chaque colonne doivent être les mêmes. De plus la phase mobile utilisée possède la même composition pour toutes les analyses effectuées. Cependant, le coefficient de distribution du soluté entre les deux phases, K, peut varier en fonction des modifications de la polymérisation. Par ailleurs, k’ dépend aussi du rapport des volumes des deux phases. Les valeurs moyennes du facteur de rétention
et du coefficient de variation (CV) associé ont été établies pour chaque prétraitement quand le nombre de colonne était suffisant. Des valeurs comprises entre 1,3 et 1,7 et des CV de l’ordre de 15 % ont été obtenus pour le butylbenzène quel que soit le prétraitement. On peut en conclure que les variations du facteur de rétention ne sont pas influencées par le type de prétraitement employé. Le composé le plus retenu, le pentylbenzène, n’a pu être étudié car le nombre d’analyses n’est pas suffisant.
4. 5. Comparaison des méthodes de prétraitement par les courbes de van Deemter
L’efficacité d’une colonne est mesurée par le nombre de plateaux N qu’elle contient. Pour comparer des colonnes de longueurs variées on utilise le paramètre H correspondant à la hauteur équivalente à un plateau théorique avec H = L/N. C’est ce dernier qui permet la comparaison des courbes de van Deemter de colonnes différentes. En effet, il n’est pas possible d’utiliser de grandeur réduite en l’état actuel des connaissances sur les monolithes, aucun paramètre issu des phases stationnaires n’ayant été défini dans l’ignorance d’une dimension caractéristique des phases stationnaires équivalentes au diamètre des particules pour les colonnes particulaires.
L’influence de la procédure de prétraitement sur l’évolution de la hauteur de plateau théorique en fonction de la vitesse de la phase mobile est présentée sur le graphe de la figure 34. Les méthodes C et D, ayant subi des rinçages basiques à chaud permettent d’obtenir des colonnes plus efficaces. Il est sûr que le rinçage basique à chaud doit dissoudre la silice et conduit ainsi à une augmentation du nombre de groupements silanol à la surface de capillaire. Ces derniers étant modifiés chimiquement, les capillaires prétraités présentent de nombreux groupements méthacrylate à la surface qui doivent jouer un rôle dans la cinétique de la réaction de polymérisation. En effet, cette réaction est menée de façon plus homogène car réalisée simultanément à partir à la fois des bords du capillaire et du centre.
Les méthodes A et C présentent une plus grande dispersion de leurs efficacités par rapport aux méthodes B et D, indiquant une meilleure répétabilité des synthèses quand ces derniers sont réalisés dans le DMF à 70°C plutôt que dans l’acide acétique à 25°C.
Figure 34 : Influence des quatre procédures de prétraitement sur l’allure des courbes de Van Deemter pour le butylbenzène. La courbe moyenne de van Deemter et les points expérimentaux ont été représentés pour chaque prétraitement.
Afin d’évaluer de façon plus approfondie l’influence des procédures de prétraitement sur l’élargissement d’une bande de soluté, les trois coefficients de l’équation de Van Deemter ont été déterminés. Les résultats obtenus pour l’un des composés les plus retenus : le butylbenzène (log P = 4,13) sont présentés dans le Tableau 3 comme composé modèle. Les coefficients de variation n’ont pas toujours été calculables du fait du peu de colonnes disponibles.
Coefficient de
van Deemter Prétraitement A Prétraitement B Prétraitement C Prétraitement D
A 0.72 0.51 0.33 0.23
B 3.28 3.31 3.27 3.19
C 1.11 0.94 0.96 0.84
Tableau 3 : valeurs des coefficients de l’équation de van Deemter ajustées selon la procédure de prétraitement. Valeurs correspondant au butylbenzène.
Le coefficient B de cette équation mesure l’apport de la diffusion longitudinale à l’élargissement des pics et semble être indépendant du protocole de prétraitement. Etant donné qu’il est relié à la tortuosité, γ, et au coefficient de diffusion moléculaire, Dm : B = 2 γ Dm, il est possible de conclure que quel que soit le type de prétraitement la tortuosité de la phase stationnaire varie peu.
3 4 5 6 7 8 9 10 11 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 v (mm/s) H (µ m)
prétraitement A prétraitement B prétraitement C prétraitement D
Le coefficient A représente l’influence des phénomènes d’anisotropie d’écoulement dus au caractère plus ou moins hétérogène de la phase stationnaire. L’évolution de ce paramètre présente une décroissance manifeste de la méthode A à la méthode D, laissant supposer que les diverses modifications des procédures sont bénéfiques à l’obtention d’une structure homogène. Cette conclusion est par ailleurs en accord avec les observations MEB réalisées. La faible valeur du coefficient C reste une des principales caractéristiques des colonnes monolithiques utilisées en ECC, par rapport à la CPL. Ce paramètre représente la résistance au transfert de masse d’un soluté. C’est pour cette raison que les courbes de Van Deemter présentent une faible remontée aux vitesses élevées en électrochromatographie par rapport à la CPL conventionnelle. L’évolution du coefficient C en fonction des protocoles présente une décroissance du A au D. Cette observation ajoute encore du crédit à cette dernière méthode de prétraitement. Par ailleurs, pour toutes les colonnes testées, le paramètre C obtenu pour chaque composé du mélange test décroît lorsque le facteur de rétention augmente.
Des tendances similaires dans la variation des coefficients A, B et C ont été observées pour les autres composés du mélange test. C’est pour l’ensemble de ces raisons que le prétraitement D a été choisi pour la synthèse des monolithes à venir. En plus des critères d’études de l’influence de plusieurs types de prétraitement tels que la mouillabilité ou les caractéristiques séparatives, il serait intéressant de voir dans quelle mesure ces prétraitements influent sur la durée de vie d’une colonne. Une étude du vieillissement des colonnes obtenues aurait permis d’apporter quelques éléments de réponse.
4. 6. Conclusions
Les meilleures conditions de prétraitement correspondent à un rinçage basique prolongé à chaud suivi d’un rinçage acide à chaud et enfin une polymérisation réalisée dans le DMF à 70°C. Par conséquent le prétraitement D a été retenu pour les synthèses de colonnes qui ont suivi cette étude. Nous n’avons pas essayé de réduire les temps des deux rinçages et de la réaction de silanisation.