Influence de la distance pointe-substrat

La même expérience est répétée pour plusieurs positions de la pointe. Pour chaque distance pointe-substrat étudiée, nous avons extrait un chronofluorogramme corres-pondant à l’évolution au cours du temps de l’intensité de fluorescence moyenne au sein de la région d’intérêt délimitée par le carré rouge (Figure4.8).

À titre d’exemples, quelques uns de ces chronofluorogrammes ont été sélection-nés et reportés sur la partie centrale de la Figure4.10(en B). Leur couleur est indi-catrice de la position à laquelle se trouvait la microélectrode lors de leur enregistre-ment. Cette position est par ailleurs représentée par un point de la même couleur sur la courbe d’approche (en haut A, courbe bleue de la Figure 4.10). Il apparait qu’à une distance pointe-substrat donnée, l’intensité de fluorescence reste constante lors des vingt premières secondes de l’enregistrement : elle n’est pas impactée par la polarisation à 0 V par rapport à Ag|AgCl de la pointe auparavant à son potentiel de circuit ouvert (PCO). Toutefois, la valeur de cette intensité augmente avec la dis-tance pointe-substrat. Ceci peut s’expliquer par le fait que, même si la mise au point

FIGURE4.10 – Modulation de l’intensité de fluorescence par variation du potentiel de la pointe et de la distance pointe-substrat en mode feedback négatif (substrat : lame de verre). A) Courant enregistré à la pointe (bleu, échelle de droite) et taux de modulation normalisé de l’intensité de fluorescence (Imax−Imin)/Imax (rose, échelle de gauche) en fonction de la position de la pointe. B) Intensité de fluores-cence en fonction du temps(chronofluorogrammes) pour différentes positions de la pointe par rapport au substrat : les couleurs font ré-férence aux positions de la pointe indiquées en A). C) Potentiel ap-pliqué à la pointe en fonction du temps pour chaque distance pointe-substrat : circuit ouvert (10 s) - 0 V (10 s) - -0,7 V (20 s) - 0 V (20 s).

Chapitre 4. Couplage de la microscopie électrochimique à balayage à la microscopie de fluorescence : utilisation d’une unique sonde à la fois électroactive et fluorescente

a par ailleurs été reportée sur la Figure4.11. Ainsi, la relation entre ces deux gran-deurs apparait comme linéaire sur l’ensemble de la gamme des distances de travail étudiées.

L’étude des chronofluorogrammes sur le milieu de la Figure 4.10montre que, lorsque le potentiel de la pointe est porté à - 0,7 V, l’intensité de fluorescence chute brusquement au sein de la ROI pour atteindre rapidement un palier. Cette chute, vi-siblement corrélée au signal électrochimique, est cohérente avec la conversion de la tétrazine fluorescente en son radical anion non fluorescent sous l’effet de la polari-sation de la microélectrode. Finalement, l’intensité de fluorescence initiale est totale-ment retrouvée lorsque le potentiel de la pointe est ramené à 0 V et cela, pour toutes les positions de la pointe : le phénomène étudié semble réversible, comme espéré avec la voltamétrie cyclique.

De plus, si une baisse de l’intensité de fluorescence est effectivement mesurée quelle que soit la distance pointe-substrat, il apparait clairement que son amplitude n’est pas constante. A partir des chronofluorogrammes, on cherche donc à évaluer la capacité de la pointe à "éteindre" localement la fluorescence de la tétrazine, et cela en fonction de sa hauteur par rapport au substrat. Pour toutes les positions de la pointe étudiées z, un taux de modulation de l’intensité de fluorescence normalisé est calculé de la façon suivante :

γ_modulation(z) = I_max(z) −I_min(z)

Imax(z) (4.1)

avec I_max(z)et I_min(z)les intensités moyennes de fluorescence calculées respecti-vement sur les plages de 17 à 19 secondes (en l’absence de réaction électrochimique), et de 37 à 39 secondes (lors de la réduction de la tétrazine en radical anion) du chro-nofluorogramme correspondant à la position z sur la courbe d’approche. La norma-lisation du taux de modulation par I_max permet de s’affranchir de la variation du volume sondé avec la distance pointe-substrat. Le résultat des amplitudes de mo-dulation de l’intensité de fluorescence normalisée ainsi calculées en fonction de la distance pointe-substrat est superposé à la courbe d’approche pour comparaison en haut de la Figure4.10.

L’analyse de cette courbe montre qu’à grande distance du substrat, le taux de modulation décroit pour tendre vers zéro. Or, sur la courbe de calibration (voir Fi-gure4.11), la linéarité de l’intensité de fluorescence avec la position de la pointe est visible sur l’ensemble des distances de travail considérées ici. Donc la pointe est tou-jours dans la profondeur de champ du microscope et cette dernière ne peut donc pas expliquer la décroissance à grande distance. En revanche, la différence Imax-I_min tend nécessairement rapidement vers une constante (fixée par le rayon d’action de la pointe qui n’est plus en interaction avec le substrat pour z grand) tandis qu’I_max augmente toujours. C’est donc la normalisation seule par Imaxqui explique cette dé-croissance.

si-FIGURE 4.11 – Représentation graphique de l’intensité de fluores-cence, émise par la solution de tétrazine et collectée dans la région d’intérêt, en fonction de la position de la pointe, superposée à sa

Chapitre 4. Couplage de la microscopie électrochimique à balayage à la microscopie de fluorescence : utilisation d’une unique sonde à la fois électroactive et fluorescente

FIGURE4.12 – A) Séquence de potentiel appliquée à la pointe B) Cou-rant de pointe mesurés pour plusieurs distances pointe-substrat.

l’amplitude du créneau du courant en réduction est constante pour des distances pointe-substrat supérieures à 60 µm. À ce stade, il est difficile de savoir si la diffé-rence de sensibilité entre le courant électrochimique et l’intensité de fluorescence est simplement due à la façon de calculer le taux de modulation et s’il s’agit d’un ar-téfact de la normalisation. Pour essayer de comprendre les phénomènes mis en jeu, une modélisation de l’expérience réalisée avec le logiciel Comsol Multiphysics est proposée dans le paragraphe4.6.

L’amplitude de la modulation de l’intensité de fluorescence normalisée augmente lorsque la distance pointe-substrat diminue. Elle finit par atteindre un maximum puis décroit à très courte distance de la même façon que le courant électrochimique. A priori, cette décroissance peut être le signe d’une réaction électrochimique moins efficace, en accord avec le mode "feedback" négatif. Elle devrait donc également pou-voir être modélisée.

Il est à noter que l’acquisition des chronofluorogrammes est faite, pour cette étude, sur de grandes échelles de temps (60 s). Toutefois, étant donné les cinétiques rapides du phénomène observé, il serait envisageable de raccourcir les temps

d’enre-FIGURE4.13 – Evolution du spectre d’émission au cours du temps pour différentes hauteurs de la pointe par rapport au substrat de verre. Le potentiel de la pointe varie selon la séquence suivante : cir-cuit ouvert (10 s) ; 0 V (10 s) ; -0,7 V (20 s) ; 0 V (20 s). Les points roses sont le taux de modulation normalisé de l’intensité de fluorescence

en fonction de la position de la pointe de la Figure4.10.

4.3.3 Caractérisation spectrale de la modulation : effet du potentiel de