Incubations en mini-fermenteurs

Les expériences en mini-fermenteurs ont été conduites pour quantifier l'influence de quatre facteurs physico-chimiques sur les fermentations: le mode d’apport du glucose, le pH initial du milieu, son potentiel d’oxydo-réduction initial et la proportion molaire d’hydrogène dans la phase gazeuse (Tableau 2). Le jour de fermentation a été inclus en tant que facteur de bloc. Les valeurs expérimentales ont été choisies de façon à couvrir la plage de variation la plus large possible en liaison avec les valeurs observées dans la littérature. Le pH a varié d'une unité pH, le potentiel a varié de 50 mV. Les quatre paramètres étudiés ont été combinés selon un plan factoriel fractionnaire de 24 expériences (Tableau 3) pour estimer leurs effets principaux, les effets quadratiques des facteurs quantitatifs, toutes les interactions d’ordre un et quelques interactions d’ordre deux faisant intervenir le mode

d’apport du glucose. Le modèle polynomial qui a guidé la recherche de la matrice d’expérience est présenté en section 2.2.4.

Tableau 2

Limites du domaine expérimental et codage des facteurs étudiés pour les incubations en mini-fermenteurs

Facteurs Symbole Niveaux Valeurs codées Méthode

-1 0 1 Valeurs expérimentales Facteurs contrôlés Période P 2 1 - 2 Jour J 2 1 - 2 Inoculum C 2 maïs blé N 3 25 37,5 50 Facteurs expérimentaux

Glucose Gl 2 0,5 - 1 Apport du glucose en en _{une fois (à t = 0) ou en}

deux fois (à t = 0 et 3 h).

pH pH 3 5,8 6,3 6,8 Ajustement du pH des _{inoculums filtrés et des}

tampons d'incubation.

Ev Ev 3 H M B Apport d'agent réducteur _{dans les tampons}

d'incubation.

Pression H2 H2 3 0 0,5 % 1 %

Contrôle de

l'atmosphère gazeuse des tubes d'incubation.

Tableau 3

Matrice d’expérience des incubations en mini-fermenteurs

N°Exp Jour Glucose pH Ev H2

1 7 0,5 5,8 H 0 4 7 0,5 6,3 M 0 5 7 1 6,3 M 0 7 7 1 5,8 B 0 8 7 0,5 6,8 B 0 10 7 0,5 6,3 H 0,5 11 7 1 6,8 H 0,5 14 7 0,5 6,8 M 0,5 17 7 0,5 5,8 H 1 22 7 0,5 5,8 B 1 23 7 1 5,8 B 1 24 7 0,5 6,8 B 1

N°Exp Jour Glucose pH Ev H2 2 8 1 5,8 H 0 3 8 0,5 6,8 H 0 6 8 0,5 5,8 B 0 9 8 1 6,8 B 0 12 8 0,5 5,8 M 0,5 13 8 1 5,8 M 0,5 15 8 0,5 6,3 B 0,5 16 8 1 6,3 B 0,5 18 8 1 6,3 H 1 19 8 0,5 6,8 H 1 20 8 0,5 6,3 M 1 21 8 1 6,8 M 1

Trois inoculums étant mis en œuvre simultanément, un total de 72 incubations a été réalisé lors de deux jours consécutifs. Le schéma expérimental a été répété lors de la période suivante.

Les incubations ont été conduites en anaérobiose dans des tubes de culture de 72 mL (Fig. 2) inoculés avec les milieux de fermentation des cuves Blé NDF B, Blé NDF H et Maï s NDF B après la phase d’adaptation au régime. Les inoculums ont été traités comme suit. Les contenus de fermenteurs ont été récoltés 12h00 après le repas de façon à obtenir un inoculum riche en bactéries et pauvre en substrat fermentescible. Ils ont été filtrés sur une toile de nylon de 50 µm, sous atmosphère de CO2 à 39°C. Pour chaque inoculum, trois

aliquots de pH 6,8, 6,3 et 5,8 ont été préparés par ajout de solution de NaOH 5N ou H2SO4 5N. Chaque tube de culture a été rempli de 12 mL d’inoculum, de 3 mL de solution

tampon (ajustée pour obtenir des pH et Ev initiaux donnés) et de 1 mL de solution de glucose (0,5 mM ou 0,25 mM) comme seul substrat énergétique, conformément au plan d’expérience. Après avoir été brièvement mis sous atmosph ère de CO2 les tubes ont été

soigneusement dégazés et remplis d’une phase gazeuse contenant une proportion donnée d’H2 (0, 0,5 ou 1 %) et de CO2. Les tubes ont été placés dans un bain-marie à 39°C et agités

de façon continue.

agitation va et vient bain-marie à 39°C

tube de culture 100mL bouchon hermétique avec système de prélèvement

- milieu contrôlé: pH, Ev, gaz (anaérobiose) - durée incubation: 6h

Le contrôle indépendant du pH et du potentiel d'oxydo-réduction dans les incubations, nécessaire pour estimer correctement les effets de ces deux variables, a nécessité une pré- étude mettant en oeuvre les contenus de fermenteur à la fin de la phase d’adaptation de la première période. Nous avions choisi de contrôler le potentiel d'oxydo-réduction par ajout de cystéine-HCl comme agent réducteur. Il s’est avéré nécessaire d’établir la relation entre pH et Ev dans les trois inoculums, puis de quantifier la réponse de ces inoculums à l’ajout de cystéine et enfin de déterminer les concentrations de cystéine nécessaires dans les solutions tampons pour se conformer au plan d’expérience.

Une très forte relation a été observée entre pH et potentiel d'oxydo-réduction, avec une pente variable selon l'inoculum (- 45, - 50 et - 63 mV / unité pH pour Blé NDF B, Maï s NDF B et Blé NDF H respectivement). Le potentiel a ensuite été mesuré sur 50 mL d'inoculum filtré à pH 5,8 et 6,8 après différents a pports de cystéine (0, 0,8 et 1,6 mg/mL). Les résultats indiquent une stabilité de la pente pour le pH. Par contre, les pentes sont différentes selon les inoculums, notamment selon le niveau de NDF. L'apport de cystéine (Cys, mg/mL) a eu un effet de type quadratique.

NDF B : Blé Ev = 200 - 51,0 pH -160 Cys + 55,7 Cys2 Maï s Ev = 175 - 51,0 pH -160 Cys + 55,7 Cys2 NDF H: Ev = 284 - 63,0 pH -87,7 Cys + 30,4 Cys2

Grâce à ces équations polynômiales, les 18 solutions tampons nécessaires à l’application du plan d’expérience ont été préparées par ajustement du pH et apport raisonné de cystéine. A chaque période, elles étaient préparées durant les jours précédant les incubations et conservées à 4°C jusqu’à utilisation.

Au bout de 3 h d’incubation, 1 mL de contenu a été prélevé et mélangé à 250 µL d'H3PO4 25% (v/v) en vue de déterminer la composition en AGV, puis 1 mL de solution

tampon (contenant ou non du glucose) a été ajouté dans chaque tube de culture. Au bout de 6 heures d’incubation, la pression dans les tubes a été immédiatement mesurée à l’aide d’un capteur de pression absolue (Druck LEO1). Les fermentations ont été stoppées par refroidissement des tubes à + 4°C, les gaz ont été analysés par CPG. Le pH du milieu de fermentation a été mesuré et 4 mL de milieu ont ensuite été mélangés à 1 mL d'H3PO4 25%

(v/v) pour l'analyse du lactate, de l’azote ammoniacal et des AGV.