Incorporation des précurseurs dans Agelas oroides

Des expériences de biosynthèse ont montré la difficulté de certains précurseurs à être incorporés par l’éponge.139 La première étape des études que nous avons menées sur

déterminer sa capacité à incorporer radioactivité nécessaire minimale ajouter 2,5 à 10 fois plus afin de pa

Activité déposée (nCi

Figure n°161 -

comprises en 0,01 et 0,09

Partie C : Biosynthèse et métabolisme secondaire des P2AI

en 14_{C du Compteur β à scintillation liquide}

Afin de comparer le seuil de détection du Radio-TLC avec celui du compteur β à

nous avons préparé les deux mêmes gammes d’étalonnage. Grâce à la première gamme, comp proline, nous avons conclu que le seuil de détection de l’appareil était nCi pour lequel le rapport signal/bruit obtenu est de 4. La seconde gamme d’étalonnage, comprise entre 0,01 et 0,09 nCi, a permis de déterminer le seuil de détection de

pour une heure de comptage, avec un rapport signal/bruit de seuil de détection est plus élevé (environ 0,1 nCi) lorsque les échantillons radioactifs sont

TLC apparaît donc plus performant que le compteur β à scintillation liquide nCi et si nous considérons une incorporation moyenne de la radio

dans les métabolites biosynthétisés (valeur déduite des différentes expériences décrites dans

il faut ajouter au minimum 0,2 µCi de précurseurs qui rentre dans les consignes de sécurité du laboratoire.

III.2.1.3. Incorporation des précurseurs dans Agelas oroides

es expériences de biosynthèse ont montré la difficulté de certains précurseurs à être incorporés par La première étape des études que nous avons menées sur Agelas oroides

incorporer les acides aminés radiomarqués ajoutés dans l’eau. nécessaire minimale de précurseur incorporé étant de 0,2 µCi, nous avons décidé d’en ajouter 2,5 à 10 fois plus afin de pallier le problème d’incorporation dans l’éponge.

Activité détectée par le Radio-TLC (nCi) déposée (nCi)

Droite d’étalonnage sur Radio-TLC pour des activités comprises en 0,01 et 0,09 nCi

: Biosynthèse et métabolisme secondaire des P2AI

177

à scintillation liquide, nous avons préparé les deux mêmes gammes d’étalonnage. Grâce à la première gamme, composée roline, nous avons conclu que le seuil de détection de l’appareil était . La seconde gamme de déterminer le seuil de détection de un rapport signal/bruit de 3. Ce lorsque les échantillons radioactifs sont colorés (cf.

liquide. Avec un seuil de de la radioactivité de 10-2 % (valeur déduite des différentes expériences décrites dans

µCi de précurseurs radiomarqués, ce

es expériences de biosynthèse ont montré la difficulté de certains précurseurs à être incorporés par Agelas oroides a donc été de marqués ajoutés dans l’eau. La µCi, nous avons décidé d’en problème d’incorporation dans l’éponge.

)

Partie C : Biosynthèse et métabolisme secondaire des P2AI

178

• Expérience 1 :

Pour cela, après 2 jours d’acclimatation dans un aquarium de 20 L d’eau de mer en circuit ouvert, un spécimen d’Agelas oroides a été coupée en 3 morceaux, nommés A, B et C, placés dans des béchers de 300 mL d’eau de mer en présence de [U-14C]-L-proline. Après 17 heures d’incorporation, les 3 morceaux d’A. oroides ont été replacés en circuit ouvert dans un aquarium de 20 L d’eau de mer (Schéma n°17).

Afin d’évaluer le taux d’incorporation de la proline dans l’éponge, la radioactivité résiduelle contenue dans chaque bécher de 300 mL a été mesurée (Tableau 22). Le bécher contrôle (D), contenant 300 mL d’eau de mer et 1 µCi de [U-14C]-L-proline, a permis de confirmer que la proline ne se fixait pas aux parois du bécher durant l’étape d’incorporation.

Tableau 22 - Taux d'incorporation de la [U-14C]-L-proline par Agelas oroides après 17 h

Nom Masse (humide) Activité ajoutée % d’incorporation

A 30 g 0,5 µCi 64 % B 30 g 1,0 µCi 76 % C 40 g 2,0 µCi 56 % D (contrôle) - 1,0 µCi 0 %

Les résultats obtenus, entre 56 et 76 % d’incorporation, indiquent une bonne incorporation de la proline par l’éponge. La technique d’incorporation des acides aminés utilisée semble donc convenir aux études de biosynthèse des P2AI chez A. oroides.

Après 7 jours de métabolisation en circuit ouvert, les 3 morceaux d’éponge ont été extraits par le mélange de solvant MeOH/CH2Cl2 1:1. Avant d’évaluer la radioactivité associée à chaque extrait brut

par compteur β à scintillation liquide, une courbe de calibration composée de six étalons, contenant 0,8 nCi de [U-14C]-L-proline dans un extrait brut d’A. oroides de plus en plus concentré, a du être créée (cf. Partie expérimentale p.302). En effet, le compteur β étant sensible à la nature du solvant

Agelas oroides

Récolte : Roches St Nicolas P = 25 m

Méponge humide = 100 g

Aquarium 20 L d’eau de mer en circuit ouvert

Béchers de 300 mL d’eau de mer en circuit fermé

A B C D

0,5 µCi 1 µCi 2 µCi 1 µCi

Agelas oroides coupée en 3 puis ajout de la [14C]-Proline

Durée d’incorporation : 17 h

A B C

Aquarium 20 L d’eau de mer en circuit ouvert

Agelas oroides coupée en 3

Durée de métabolisation : 7 jours

Partie C : Biosynthèse et métabolisme secondaire des P2AI

179

Figure n°162 - Nécrose des éponges

et la coloration de l’échantillon (effet de « quenching »), il est nécessaire d’établir une courbe de calibration permettant de déterminer la radioactivité réelle d’un échantillon d’après la valeur mesurée par l’appareil.

Après séchage, chaque extrait brut a été solubilisé dans 6 mL de solvant MeOH/CH2Cl2 1:1. 2 mL ont

été prélevés dans lesquels ont été ajoutés 10 mL de scintillant (Ultima Gold XR, Perkin Elmer). La radioactivité de ces échantillons ainsi préparés a été mesurée par le compteur β en utilisant la courbe de calibration préalablement réalisée (Tableau 23).

Tableau 23 - Radioactivité des extraits brut d'A. oroides

Nom Masse (mg) Activité (nCi) Incorporation de la radioactivité (%)

A 448 4,0 1,25 % B 582 12,0 1,58 % C 747 3,0 0,27 %

Par cette expérience, plus de 50 % de la [U-14C]-L-proline ont été incorporés dans l’éponge et environ 1 % de la radioactivité a été retrouvée dans son extrait brut. Malheureusement, durant la phase de métabolisation, les 3 morceaux d’éponge se sont nécrosés et un développement bactérien est apparu (Figure n°162). Le fait d’avoir coupé l’éponge juste avant l’étape d’incorporation en circuit fermé en est certainement la cause.

• Expérience 2 :

Cependant, malgré la nécrose des 3 morceaux d’éponge, une quantité suffisante de radioactivité était présente dans les extraits bruts d’A. oroides pour être détectée par le compteur β. Afin de valider le protocole d’incorporation et de métabolisation des précurseurs dans l’éponge, l’expérience a été renouvelée avec quatre spécimens d’A. oroides, nommées A2 à D2, non coupés avant l’étape d’incorporation et en utilisant 1 µCi de [U-14C]-L-proline par éponge (Schéma n°18).

Partie C : Biosynthèse et métabolisme secondaire des P2AI

180

Après 15 heures d’incorporation, les quatre de 20 L d’eau de mer en circuit ouvert et la r Ce deuxième essai a montré une incorporation

24). La technique utilisée semble oroides. Le taux d’incorporation nécrose des morceaux d’éponge.

Tableau 24 - Taux d'incorporation de la Nom Masse (humide)

A2 B2 C2 D2

Après 6 jours de métabolisation, voile bactérien n’était visible. L MeOH/CH2Cl2 1:1 et la radioactivité

liquide dans les mêmes conditions que celles de la première expérience métabolisation de cette deuxième expéri

afin, d’une part de vérifier leur survie lorsqu’elles sont gardées plus longtemps en aquarium après incorporation des précurseurs radiomarqués

radioactivité des extraits bruts entre 6

éponges C2 et D2 ne présentaient aucune nécrose, la nécrose et le développement bactérien des morceaux d’éponge de la première expérience semble

infligées. Cette deuxième expérience, sans nécrose des éponges durant l’étape de métabolisation, a montré que le protocole d’incorporation et de métabolisation

des P2AI chez A. oroides.

Schéma n°18 - Validation du protocole d’incorporation et de métabolisation de la

par A. oroides

: Biosynthèse et métabolisme secondaire des P2AI

Après 15 heures d’incorporation, les quatre spécimens d’éponge ont été replacé L d’eau de mer en circuit ouvert et la radioactivité résiduelle des 300 mL d

une incorporation quasi-totale de la proline dans les éponges

semble donc très adaptée à l’incorporation d’acides aminés dans . Le taux d’incorporation plus faible obtenu lors du premier essai est certainement

des morceaux d’éponge.

Taux d'incorporation de la [U-14C]-L-proline dans Agelas oroides

Masse (humide) Activité ajoutée % d’incorporation

31 g 1,0 µCi 99 %

12 g 1,0 µCi 93 %

13 g 1,0 µCi 98 %

33 g 1,0 µCi 85 %

Après 6 jours de métabolisation, les quatre éponges n’ont montré aucun signe de nécrose et aucun voile bactérien n’était visible. Les éponges A2 et B2 ont été extraites par le

la radioactivité leur extrait brut a été mesurée par un compteur β dans les mêmes conditions que celles de la première expérience (Tableau

métabolisation de cette deuxième expérience a été allongée à 22 jours pour les éponges C

vérifier leur survie lorsqu’elles sont gardées plus longtemps en aquarium après incorporation des précurseurs radiomarqués, et d’autre part pour évaluer la différence de ité des extraits bruts entre 6 et 22 jours de métabolisation. Avant leur extraction, les ne présentaient aucune nécrose, la nécrose et le développement bactérien des morceaux d’éponge de la première expérience semblent donc être la conséq

Cette deuxième expérience, sans nécrose des éponges durant l’étape de métabolisation, a protocole d’incorporation et de métabolisation convient aux études de biosynthèse

Validation du protocole d’incorporation et de métabolisation de la [U-

replacés dans un aquarium mL d’eau a été mesurée.

de la proline dans les éponges (Tableau

très adaptée à l’incorporation d’acides aminés dans A. est certainement dû à la

Agelas oroides

aucun signe de nécrose et aucun mélange de solvant compteur β à scintillation

Tableau 25). L’étape de

à 22 jours pour les éponges C2 et D2 vérifier leur survie lorsqu’elles sont gardées plus longtemps en aquarium après évaluer la différence de Avant leur extraction, les ne présentaient aucune nécrose, la nécrose et le développement bactérien des être la conséquence des blessures Cette deuxième expérience, sans nécrose des éponges durant l’étape de métabolisation, a

études de biosynthèse

Partie C : Biosynthèse et métabolisme secondaire des P2AI

181

Tableau 25 - Radioactivité des extraits brut d'A. oroides

Nom Masse (mg) Activité (nCi) Incorporation de la radioactivité (%)

A2 840 2,5 0,28 % B2 500 8,8 0,96 % C2 380 6,5 0,70 % D2 440 3,2 0,41 %

Malgré un taux d’incorporation de la [U-14C]-L-proline plus important dans les éponges, la

radioactivité associée aux quatre extraits bruts semblent légèrement plus faible que celle de la première expérience. Lors de la première expérience, il est possible que les bactéries aient utilisé de la proline radiomarquée pour leur propre développement. Le voile bactérien ayant été extrait avec les morceaux d’éponge, cette hypothèse permettrait d’expliquer les activités des extraits bruts obtenus.

La radioactivité associée à l’extrait A2 est faible par rapport à sa masse, cette valeur peut s’expliquer par le fait que l’échantillon, très coloré du fait de sa concentration, n’entre pas dans la gamme de coloration de la courbe de calibration créée (Partie expérimentale p.302). Il est donc possible que l’équation déterminée par cette courbe ne soit pas applicable à l’échantillon.

Malgré une radioactivité des extraits bruts légèrement plus faible que lors de la première expérience, nous avons jugé que l’ajout d’1 µCi de précurseur était suffisant pour détecter une incorporation dans les métabolites secondaire de l’éponge. Ce deuxième essai a également permis de valider le protocole d’incorporation et de métabolisation des précurseurs à utiliser pour les études de biosynthèse que nous voulions menées sur Agelas oroides.

Une fois la quantité de radioactivité fixée, nous avons déterminé le temps nécessaire à l’éponge pour incorporer le maximum de précurseur durant l’étape d’incorporation, durée arbitraire dans les deux premières expériences décrites ci-dessus.