Implication de la voie Wnt/β-caténine dans le cancer du sein

(hétérogénéité des tumeurs au niveau de l‟expression de P53 et BRCA1) et ERBB2 (hétérogénéité des tumeurs au niveau de l‟expression de ER).

Tableau 5 : caractéristiques des principaux sous-types moléculaires du cancer du sein. Sous-type Origine Phénotype Type histologique Pronostic

du carcinome

RE- ERBB2- - Canalaire de grade III

Basal cellule PR- CK5/6+ - Médullaire Défavorable

Myoépithéliale EGFR+ - Métaplastique

ERBB22+ - Apocrine

HER2 Non connu CK8/18+ - Canalaire de grade II Défavorable

CK19+ et III

RE+

Luminal Cellule luminale CK8/18+ - Canalaire de grade I Favorable

CK19+

4.5. Implication de la voie Wnt/β-caténine dans le cancer du sein.

L‟utilisation de différents modèles animaux a permis de mettre en évidence que la surexpression de Wnt-1 induit la carcinogenèse mammaire chez la souris et que cet effet est dépendant de LRP5 (Lindvall et al 2006, Nusse and Varmus 1982). Dans le cancer du sein chez l‟homme, la β-caténine est fréquemment localisée dans le comportement nucléaire, indiquant une activité intense de la voie Wnt/β-caténine (Geyer et al 2011). La localisation nucléaire de la β-caténine est associée aux cancers mammaires triples négatifs. De plus, la suractivation de la voie wnt/β-caténine a été trouvée associée aux sous types moléculaire basal et luminal B (Smid et al 2008). Ces observations suggèrent fortement que la voie Wnt/β-caténine soit impliquée dans le cancer de sein chez l‟homme.

Cependant, on ne trouve pas, ou rarement, dans le cancer du sein comme dans le cancer du côlon de mutations dans les gènes APC, axine ou β-caténine conduisant à une suractivation de la voie Wnt/β-caténine (Alexander et al 2012). D‟autres mécanismes seraient donc responsables de la suractivation de cette voie dans le cancer du sein. Différentes études suggèrent que ces mécanismes pourraient être la surexpression de ligands Wnt, de LRP6 et/ou de la sous expression d‟inhibiteurs extracellulaires de cette voie comme sFRP1 (Alexander et al 2012).

La surexpression de Wnt1 dans la glande mammaire de souris induit la prolifération de cellules ayant des propriétés de cellules souches, et cet effet est crucial à Wnt1 pour stimuler la carcinogenèse mammaire (Li et al 2003, Shackleton et al 2006).En outre, la stimulation de la prolifération de ces cellules par Wnt1 est dépendante de LRP5 (Lindvall et al 2006).

47

La suractivation de la voie Wnt/ β-caténine induirait donc la carcinogenèse mammaire en stimulant la prolifération de cellules souches ou progénitrices.

48

49 Objectifs de la thèse :

L‟objectif de ce travail de thèse est d‟arriver à mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables du cancer du sein. La stratégie adoptée est l‟étude du mode d‟action moléculaire du gène suppresseur de tumeur WWOX dont le rôle dans la carcinogenèse mammaire est suggéré fortement par divers observations et arguments expérimentaux. Ce travail de thèse s‟inscrit dans un projet qui a débute longtemps avant mon arrivé dans mon laboratoire d‟accueil. L‟hôpital René Huguenin est un centre de lutte contre le cancer du sein. En plus du service hospitalier, différentes équipes de recherches cherchent depuis des années à mieux comprendre les mécanismes moléculaires du cancer du sein ainsi que de mettre en évidence de nouveaux marqueurs à valeurs cliniques. Dans le laboratoire d‟oncogénétique, K. Driouch a recherché les gènes suppresseurs de tumeur présents dans les régions chromosomiques spécifiquement altérées dans les métastases de cancer du sein (Driouch et al 1998, Driouch et al 2002). Cette démarche a abouti au clonage du gène WWOX localisé en 16q23.3-24.1, et comprenant le site fragile FRA16D (Bednarek et al 2001, Chang et al 2001, Ried et al 2000). Par la suite l‟étude fonctionnelle de ce gène a été entreprise. Dr Lallemand, mon directeur de thèse, en collaboration avec l‟entreprise „Hybrigenics‟ a recherché de nouveaux partenaires de WWOX à l‟aide du système de double hybride chez la levure.

Figure 12 : Schéma représentatif du système double hybride chez la levure.

Le principe du système double hybride chez la levure est basé sur la reconstruction d‟un facteur de transcription quand deux protéines interagissent. A l‟aide de ce système, nous avons recherche les partenaires moléculaires de WWOX et ce, en réalisant la conjugaison de deux types de levure. Le premier type exprime WWOX fusionnée à un domaine protéique s‟associant spécifiquement à l‟opérateur LexA. Le deuxième possède dans son gènome le gène de la β-galactosidase sous contrôle de l‟opérateur LexA. De plus, ce type de levure exprime une banque de cDNA, symbolisé par X, fusionnée à un domaine protéique capable d‟activer la transcription, le domaine AD. Après conjugaison, si la protéine X interagit avec WWOX, le domaine AD est recruté sur l‟opérateur LexA et ainsi la transcription de la β-galactosidase est activé. L‟expression de la β-galactosidase permet donc d‟isoler les levures exprimant un partenaire moléculaire de WWOX. L‟identification de ce partenaire passe par la purification et le séquençage du cDNA codant pour X ainsi que l‟interrogation de banques de données appropriées.

50

Deux « appâts » ont été utilisés : WWOX « Wild Type » et FROIII, une forme tronquée de WWOX possédant les domaines WW et une partie du domaine SDR. Cette approche a permis d‟identifier de nombreux nouveaux partenaires de WWOX dont Dvl-2 et BCL9-2. BCL9-2 a été retrouvé dans les deux criblages FORIII et WWOX WT et Dvl-2 a été retrouvé dans le criblage FORIII.

BCL9-2 et Dvl-2 sont des acteurs essentiels de la voie de signalisation intracellulaire Wnt/β-caténine, voie impliquée dans le développement de différents cancers.

Cependant, aucune donnée bibliographique n‟avait encore évoqué un rôle de WWOX dans la modulation de cette voie. Nous avons alors entrepris l‟étude du rôle de WWOX et de ses partenaires moléculaires dans la régulation de la voie Wnt/β-caténine et la carcinogenèse mammaire:

1. Tout d‟abord, nous avons voulu valider les résultats du double hybride et rechercher les domaines d‟interaction à l‟aide d‟expériences de co-immunoprecipitation.

2. Nous avons déterminé le rôle de WWOX dans la modulation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine. Pour cela, nous avons eu recours à différentes approches expérimentales dont principalement le système de la luciférase « assay » utilisant un plasmide nommé TOP Flash qui permet de quantifier l‟activité de la voie Wnt/ β-caténine au sein d‟une lignée cellulaire.

3. Suite à cela, nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels WWOX régule l‟activité de la voie Wnt/β-caténine.

4. Nous avons également étudié le rôle des partenaires de WWOX dans la cancérogenèse mammaire. En ayant recours à la tumorotèque de l‟hôpital René Huguenin, nous avons determiné l‟expression des partenaires de WWOX que nous avons mis en évidence dans des tumeurs de sein par RT-PCR.

Nos résultats ont fait l‟objet de deux articles :

Le premier, a été publié dans le journal scientifique „Oncogene‟ le 16 juillet 2009, le second est en cours de soumission.

Dans ce manuscrit j‟ai inséré les deux articles et je présente des résultats ne faisant pas encore le sujet d‟un article. A la fin du manuscrit, je présente également un article réalisé en collaboration avec une équipe travaillant au CEA.

51

52