Implication du stress oxydant et de p38MAPK dans l’activation de la voie des sphingolipides et l’angiogenèse induite par les LDL oxydées

Le stress oxydant joue un rôle important dans l’activation de la nSMase (Levy, Castillo et al. 2006), notamment sous l’effet de H2O2 (Cinq-Frais, Coatrieux et al. 2013).

Nous avons vu que l’activation de la nSMAse2 est dépendante de sa phosphorylation (Filosto, Ashfaq et al. 2012) qui peut survenir en réponse à différents agents signalants. La nSMase2 peut être notamment phosphorylée par p38MAPK sous l’effet du TNF-Į, et induire une augmentation de l’expression des molécules d’adhésion, ICAM-1 et VCAM-1 (Clarke, Truong et al. 2007), ainsi qu’une augmentation de la synthèse de eNOS via l’activation de SK1 et la génération de S1P (De Palma, Meacci et al. 2006), permettant d’évoquer l’implication de ces deux protéines (nSMase2 et p38MAPK) dans la migration et l’angiogenèse des cellules endothéliales.

En tenant compte de ces données, nous avons recherché l’effet de deux antioxydants, la NAC (N- acétyl-cystéine) et le trolox ainsi que l’effet du SB203580 (inhibiteur de l’activité de phospho- p38MAPK), sur l’activation à 2h de la nSMase2, et sur la tubulogenèse in vitro, induite par des doses angiogéniques des LDLox.

Ces résultats montrent que le stress oxydant et l’activité de p38MAPK sont nécessaires à l’activation de la voie des sphingolipides qui médie la signalisation angiogénique des LDLox sur les HMEC-1. L’activation de p38MAPK étant consécutive à sa phosphorylation, nous nous sommes intéressés à la cinétique de phosphorylation de p38MAPK en western blot sur des extraits cellulaires d’HMEC-1, ainsi qu’aux modulations de cette phosphorylation sous l’effet de divers inhibiteurs.

Fig 2.3.2. Inhibition de l’activation de nSMase2 dépendant des LDLox, en présence des antioxydants NAC et trolox, et en présence de SB203580, un inhibiteur pharmacologique de l’activité de phospho- p38MAPK. Le trolox est utilisé à 10µM, la NAC à 1mM, le SB203580 à 10µM et sont pré-incubés pendant 30 minutes avant la stimulation des cellules par 50 µg/ml des LDLox pendant 2 heures.

Fig 2.3.1. Blocage de l’effet angiogénique des LDLox in vitro, par des antioxydants NAC et trolox, et par le SB203580, un inhibiteur pharmacologique de l’activité de phospho-p38MAPK. Le trolox est utilisé à 10µM, la NAC à 1mM, le SB203580 à 10µM et sont déposés sur le Matrigel™ en même temps que les LDLox (20µg/ml) et les cellules (50 000/puits), puis incubés à 37°C pendant 18 heures.

Nous retrouvons une phosphorylation de p38MAPK dès 30 minutes de stimulation des cellules par des doses angiogéniques de LDLox, ce qui correspond à un temps d’activation plus précoce que celui de la nSMase2 (2h) et de la SK1 (2h-3h), ajoutant un argument supplémentaire pour positionner p38MAPK en amont de la voie des sphingolipides, d’autant plus que le DMS n’a pas d’effet sur la phosphorylation de p38MAPK induite par les LDLox (figure 2.3.3.).

De plus il est intéressant de noter que la phosphorylation de p38MAPK observée à 30 minutes est inhibée par l’utilisation d’un antixoydant, le trolox (figure 2.3.3.), plaçant l’activation de p38MAPK en aval de la génération de ROS par les cellules.

Enfin, comme attendu, le SB203580 qui est un inhibiteur de l’activité kinase de p38MAPK mais qui n’empêche pas sa phosphorylation, n’a pas d’effet sur la phosphorylation de cette protéine induite par les LDLox.

En conclusion de cette partie, nous pouvons dire que nous avons montré que la génération de S1P consécutive à l’activation de la SK1 sous l’effet des LDLox à doses angiogéniques, est étroitement liée à l’activation en amont de la nSMase2 dans des cellules endothéliales in vitro. L’utilisation du GW4869, un inhibiteur pharmacologique de la nSMase2 bloque efficacement l’activation de la SK1 et l’angiogénèse, induites par les LDLox in vitro sur des HMEC-1. Des expérimentations de tubulogenèse et d’activation enzymatique sous l’effet de doses angiogéniques de LDLox en présence de siRNA de nSMase2 sont actuellement en cours afin de fournir des arguments supplémentaires concernant l’implication de la voie des sphingolipides dans l’angiogenèse induite par les LDLox in vitro.

Un travail montrant l’implication de la nSMase2 a également été débuté in vivo chez des souris C57BL/6 ayant des « plugs » sous cutanés de Matrigel™ au niveau des flancs, contenant des LDLox à doses angiogéniques ou seulement du PBS (plug contrôle), et recevant des injections régulières de GW par voie systémique à la dose de 1mg/kg de poids corporel, ainsi que chez des souris Fro (fragilitas ossium) (ayant un gène smpd3 codant pour une nSMase2 non fonctionnelle) ayant également des « plugs » de Matrigel™ au niveau des flancs, contenant des doses angiogéniques de LDLox ou seulement du PBS (plug contrôle). Les résultats sont encourageants mais une forte variabilité interindividuelle de l’angiogenèse au niveau des « plugs » chez la souris nous a conduit à utiliser un autre modèle in vivo, la membrane chorio-allantoïque d’embryons de poulets (CAM), qui semble pour l’instant plus reproductible et qui permet d’inclure un plus grand nombre d’individus à Fig 2.3.3. (A) Cinétique de phosphorylation de p38MAPK dans les HMEC-1 sous l’effet de doses angiogéniques de LDLox. (B) Inhibition de la phosphorylation par un antioxydant, le trolox. Le GW4869 est utilisé à la concentration de 10µM, le SB203580 à 10µM, le DMS à 1µM, et sont pré-incubés pendant 30 minutes avant la stimulation des cellules par 50 µg/ml de LDLox. L’anticorps monoclonal Phospho-p38MAPK (Thr180/Tyr182) vient de chez Cell Signaling.

chaque expérimentation, alors qu’il est plus difficile d’inclure un très grand nombre de souris Fro -/- car ces animaux ont un taux de reproduction assez faible.

Dans les expérimentations in vitro, l’utilisation de molécules antioxydantes comme le trolox ou la N-acétylcystéine (NAC) bloquent de façon significative l’activation enzymatique de la nSMase2 et l’angiogénèse qui s’ensuit, soulevant l’importance du stress oxydant dans notre étude. La phosphorylation de p38MAPK survenant plus précocement que l’activation de la nSMase2 et de la SK1, ainsi que le blocage de l’activation de nSMase2 par le SB203580, un inhibiteur de l’activité de phospho-p38MAPK, suggère que l’implication du stress oxydant dans l’activation de la voie des sphingolipides se fait par l’intermédiaire de p38MAPK, déjà décrite comme indispensable pour la transmission du signal angiogénique des LDL oxydées (Dandapat, Hu et al. 2007).

Fig. 2.3.5. Schéma de synthèse de la deuxième partie.

L’effet angiogénique de faibles doses (20 à 50 µg/ml) de LDL oxydées sur les HMEC-1, nécessite l’activation de la voie des sphingolipides nSMase2/SK1 via la génération de ROS et l’activation de p38MAPK.

Fig 2.3.4. Angiogenèse in vivo sur « plugs » de Matrigel™ injectés au niveau des flancs chez la souris. L’angiogenèse dans les plugs contenant de faibles doses (50 µg apoB/ml) de LDLox est comparée au plug contrôle (PBS seul) pour chaque animal. Les souris sauvages C57/Bl6 sont injectées en intrapéritonéal tous les 3 jours avec du GW à la dose de 1mg/kg de poids corporel. Les souris Fro ne reçoivent aucun traitement après la mise en place des plugs.

Control

A : Souris C57BL/6 Wt/wt

Ox50 Ox50+GW Control Ox50 B : Souris 129 Fro/fro Control Ox50 C : Souris 129 Fro/wt Control Ox50 D : Souris 129 Wt/wt Control A : Souris C57BL/6 Wt/wt

Ox50 Ox50+GW Control Ox50 B : Souris 129 Fro/fro

Control Ox50 C : Souris 129 Fro/wt

Control Ox50 D : Souris 129 Wt/wt

Ce travail nous a donc permis de faire le lien entre le stress oxydant et la génération de S1P à l’origine de l’angiogénèse observée sous l’effet des LDLox à faible dose.

Cependant des questions persistent, notamment sur les mécanismes d’activation de la nSMase2 et sur le lien entre p38MAPK et la nSMase2.

2.4. Des métalloprotéases sont impliquées dans l’activation de la voie des sphingolipides et