Chapitre 4. Discussion
4.1 Implication du récepteur FcγRIIA dans la réponse aux CIs médiée par les microglies
L’étude de l’implication du récepteur FcγRIIA dans la réponse aux CIs a été effectuée in vitro à l’aide de microglies isolées de cultures primaires gliales murines. La pureté moyenne des cellules microgliales isolées dans notre projet est similaire, voire même meilleure, à la pureté obtenue dans d’autres études d’isolation de cellules microgliales provenant de cultures primaires 338-340. Le
récepteur FcγRIIA étant connu pour être exprimé par les microglies humaines 312, 320, nous avons
voulu confirmer son expression chez les microglies isolées à partir de cultures primaires provenant de souris C57BL/6J::FcγRIIATGN
. L’expression du récepteur a tout d’abord été confirmée par
cytométrie en flux lors d’une expérience explorative (résultats non présentés) et par immunofluorescence lors de la présente étude. Les deux techniques ont démontré une faible expression du récepteur FcγRIIA par la majorité des microglies analysées, ce qui concorde avec les taux d’expression observés chez les microglies humaines en condition non pathogénique 312, 313, 320.
Afin d’étudier la réponse microgliale médiée par les CIs, des HA-IgGs ont été utilisés à titre de substituts des CIs dans notre étude. Une concentration d’HA-IgGs de 0,5 mg/mL a été ajouté dans les milieux de culture afin d’évaluer la réponse microgliale, ce qui correspond à ce qui est observé dans la littérature afin d’étudier la réponse aux anticorps par les macrophages périphériques 341. La
comparaison de la réponse aux HA-IgGs entre les deux types de populations microgliales (FcγRIIATGN et FcγRIIAnull) a permis de déterminer l’implication du récepteur FcγRIIA dans la
réponse microgliale médiée par les CIs. Pour ce faire, la morphologie ainsi que la libération de cytokines/chimiokines ont été évaluées après 24 heures de stimulation aux HA-IgGs.
Les changements morphologique des microglies dans le développement normal et pathogénique est un phénomène connu 342 et résulte de la modification de l’expression protéique de diverses molécules
d’adhésion cellulaire. La morphologie amiboïde des microglies observée en réponse aux HA-IgGs, lorsque comparée avec la morphologie ramifiée des microglies en réponse au PBS, suggère la modification du profil d’activation des microglies en réponse aux anticorps sous forme de CIs. Toutefois, aucune différence de taille n’a été observée entre les microglies FcγRIIAnull et les
microglies FcγRIIATGN. Ces résultats suggèrent que les CIs activent les microglies et que d’autres
récepteurs pourraient être impliqués dans cette réponse, notamment d’autres récepteurs FcRs exprimés naturellement par la microglie chez la souris (e.g. FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, FcγRIV).
Afin d’évaluer davantage le rôle du récepteur FcγRIIA dans la réponse microgliale, nous nous sommes intéressés à la libération de cytokines et de chimiokines médiées par les deux types de populations microgliales. Après 24 heures de stimulation aux HA-IgGs, plusieurs cytokines et chimiokines pro-inflammatoires ont été libérées par les microglies, indépendamment de l’expression du récepteur FcγRIIA. Il est important de préciser que plusieurs des cytokines et chimiokines libérées par les microglies in vitro en réponse aux HA-IgG ont aussi été détectées dans le CSF de personnes atteintes du neurolupus 155, 343-345; notamment, l’IL-6 et le TNFα, des cytokines bien connues pour
jouer un rôle dans diverses pathologies auto-immunes, telles que le LED 155. Plusieurs chimiokines
impliquées dans le recrutement de cellules immunitaires ont aussi été libérées en fortes concentrations (e.g. IP-10, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, RANTES), ce qui suggère l’implication potentielle des microglies dans le recrutement cellulaire observé au cerveau dans le neurolupus en réponse aux CIs
345, 346.
D’autres équipes de recherche se sont aussi intéressées à la réponse microgliale in vitro en réponse aux anticorps dans le but d’étudier les mécanismes de la pathologie du neurolupus 260, 261.
Contrairement à notre étude, la réponse microgliale aux anticorps fut évaluée à l’aide de sérum de personnes atteintes du LED. Toutefois, certaines similitudes furent observées entre les deux études dans la libération de cytokines et de chimiokines 261.
Bien qu’aucune implication du récepteur FcγRIIA n’ait été observée dans la réponse microgliale médiée par les CIs in vitro, cette étude a permis d’évaluer la libération plusieurs cytokines et chimiokines par les microglies en réponse aux CIs. L’implication du récepteur FcγRIIA ayant été investiguée in vitro à l’aide de microglies isolées, cette étude ne prend pas en compte les interactions complexes des microglies avec les autres cellules du SNC, qui peuvent, elles aussi, libérer de nombreuses molécules inflammatoires et ainsi modifier la réponse microgliale. Afin de confirmer l’implication du récepteur en réponse aux CIs par les microglies, plusieurs expériences pourraient être effectuées. Il serait possible de comparer le phénotype des microglies in vivo chez le modèle du LED classique (n’exprimant pas le récepteur) avec notre modèle de souris du LED exprimant le récepteur FcγRIIA. Tel que présenté dans ce mémoire, ces deux modèles possèdent une quantité similaire d’anticorps au cerveau en présence de signes avancés de la maladie. De ce fait, il serait possible de comparer l’activation microgliale en réponse aux CIs directement dans notre modèle. Par la suite, d’autres expériences in vitro pourraient être effectuées afin de confirmer les mécanismes impliqués à l’aide d’une co-culture composée de cellules gliales et de neurones. Les différents récepteurs FcγRs pourraient être bloqués avec des inhibiteurs afin d’évaluer leur implication individuels.
4.2 Expression du récepteur FcγRIIA dans le cerveau de souris C57BL/6J
et NZBxNZW(F1)
Dans le but de bien comprendre le rôle du récepteur FcγRIIA, nous avons étudié l’expression cérébrale du récepteur chez le modèle murin C57BL/6J::FcγRIIATGN. Chez l’humain, l’expression du
récepteur FcγRIIA a été observée dans le cerveau par les microglies 320. Il est décrit que les souris
C57BL/6J::FcγRIIATGN et NZBxNZW(F1)::FcγRIIATGN présentent des niveaux d’expression du
récepteur FcγRIIA similaires à l’humain, et ce au sein des macrophages et des plaquettes 333.
Toutefois, l’expression de ce récepteur par les cellules du cerveau chez ces modèles murins n’a pas été évaluée jusqu’à présent.
Dans le cadre de cette étude, nous avons évalué l’expression cérébrale du récepteur FcγRIIA pour la première fois dans un modèle murin transgénique. Des cellules FcγRIIA positives ont été observées par immunofluorescence uniquement dans les barrières du SNC (méninges, plexus choroïdiens et vaisseaux sanguins). Les microglies n’ont présenté aucun marquage FcγRIIA positif par immunofluorescence dans le parenchyme cérébral, contrairement à ce qui a été décrit chez l’humain (microglies) 320, et à ce qui a été observé lors des expériences in vitro menées dans le cadre de ce
résultats s’expliquent par une expression trop faible du récepteur FcγRIIA par les microglies in vivo, ce qui limiterait l’efficacité de la technique d’immunofluorescence. De plus, les expériences in vitro de notre étude ayant utilisé des microglies de cultures primaires gliales provenant de souris de 0 à 3 jours de vie suggèrent que les différences observées puissent provenir de l’âge des souris utilisées lors des deux expérimentations (in vitro et in vivo) ou du passage en culture. Pour vérifier ces hypothèses, d’autres investigations pourront être effectuées afin d’évaluer l’expression du récepteur par les microglies chez les souris C57BL/6J::FcγRIIATGN et les souris NZBxNZW(F1)::FcγRIIATGN
à l’aide d’une autre technique, telle que la cytométrie en flux. Des cerveaux de souris de 0 à 3 jours de vie pourront être utilisés afin d’évaluer l’expression du récepteur FcγRIIA in vivo à la naissance.
Bien que les microglies n’aient pas présenté de marquage FcγRIIA positif lors de cette étude, d’autres cellules IBA1 positives ont présenté des signes d’expression du récepteur. Par leur expression du marqueur IBA1, leur morphologie, ainsi que leur localisation (à l’intérieur des barrières du SNC (méninges, plexus choroïdiens, vaisseaux sanguins)), les cellules FcγRIIA positives ont été identifiées comme étant des macrophages des méninges, des macrophages des plexus choroïdiens et des macrophages périvasculaires 238, 347. Par conséquent, il serait intéressant d’évaluer l’implication du
récepteur FcγRIIA dans la réponse aux CIs par ces macrophages du cerveau in vitro. Pour ce faire, une co-culture de cellules endothéliales, d’astrocytes et de macrophages périvasculaires isolées de nos modèles murins FcγRIIATGN permettrait d’évaluer la réponse des macrophages FcγRIIA positifs
en présence de CIs. Dans le cadre d’expériences in vivo, une analyse par séquençage à ARN pourrait être effectuée sur les cellules isolées des méninges et des plexus choroïdiens 348. Cette technique
permettrait de comparer le profil d’ARN des macrophages du cerveau de nos deux modèles du LED (FcγRIIATGN et FcγRIIAnull) et de déterminer l’implication de l’expression du récepteur FcγRIIA dans
l’activation cellulaire. Ces cellules étant localisées à l’interface entre les vaisseaux sanguins et le parenchyme cérébral, il est possible qu’elles contribuent à l’intégrité des barrières du SNC. L’imagerie en microscopie électronique, combinée à différentes techniques de marquage cellulaire, pourrait être utilisée dans le but d’analyser le rôle des macrophages à l’intérieur des barrières du SNC. La morphologie de ces cellules, leurs interactions cellulaires ainsi que l’intégrité de la BHE, de la BCSFB et de la BHE pourraient être investiguées avec ce type d’expériences.
Dans ce projet, la densité cellulaire des macrophages FcγRIIA positifs des méninges et des plexus choroïdiens a été quantifiée chez les souris modèles du LED NZBxNZW(F1)::FcγRIIATGN par
analyses bio-informatiques. Ces cellules ont été quantifiées avant l’apparition de signes de dommages sévères aux reins, soit à 9 semaines d’âges, ainsi qu’en présence de dommages sévères aux reins,
entre 21 à 28 semaines. Une augmentation non significative de la densité cellulaire des macrophages FcγRIIA positifs, des méninges et des plexus choroïdiens, a été observée dans le développement du LED. De façon similaire, la densité cellulaire de ces macrophages est aussi augmentée dans la pathologie de la sclérose en plaques, une autre maladie auto-immune affectant le SNC 349.
Les macrophages situés dans les barrières du SNC jouent un rôle majeur dans le maintien de la perméabilité des barrières du cerveau, le recrutement de cellules immunitaires et la protection du SNC contre les agents pathogènes 239. Ces cellules ont aussi été démontrées pour jouer un rôle dans les
dysfonctions cognitives et neurovasculaires observées chez un modèle murin d’hypertension350, ainsi
que dans le développement de la sclérose en plaques, où ces cellules semblent jouer un rôle important dans le développement de la pathologie 351. En effet, la déplétion de ces cellules dans un modèle murin
de la sclérose en plaques freine la progression de la maladie 349. Afin de confirmer une augmentation
de la densité cellulaire de ces macrophages dans la pathologie du LED et d’évaluer le rôle de ces cellules dans le développement des manifestations du neurolupus, d’autres investigations devront être menées avec un plus grand nombre d’animaux. L’expression du récepteur FcγRIIA par les macrophages des barrières du SNC chez les souris transgéniques suggère une potentielle implication du récepteur dans le développement du neurolupus en réponse aux CIs. Les macrophages des méninges, des plexus choroïdiens et de la neurovasculature jouant un rôle dans l’intégrité des barrières du SNC et le recrutement de cellules immunitaires au cerveau, il est possible de suggérer que l’expression du récepteur FcγRIIA par ces populations de macrophages puisse jouer un rôle dans l’activation de l’inflammation au cerveau en réponse aux CIs.