2.1 Contexte et objectifs
Un défi majeur dans le domaine de la métagénomique est d'identifier les espèces bactériennes, les associations des gènes bactériens et les phénotypes qui agissent pour moduler les populations microbiennes et ce afin d'améliorer la santé humaine. Le projet MetaHIT aborde ce défi en développant et en intégrant un certain nombre d'approches à haut débit. Dans le cadre de ce projet, des espèces présentant 90% de similitudes au niveau des séquences avec S. thermophilus ont été détectées chez 124 européens (Qin et al., 2010). Même si le genre Streptococcus est détecté dans les fèces de nouveau né (Perez et al., 2007; Solis et al., 2010), une étude sur la phylogénie du microbiote humain a démontré que S. thermophilus n’appartient pas aux groupes de bactéries dominantes qui constituent le microbiote (Tap et al., 2009). Néanmoins la consommation régulière de produits laitiers ou de probiotiques permet un apport constant de S. thermophilus dans le TD.
L’objectif de ce travail est d’étudier le métabolisme de S. thermophilus dans le TD chez des rats gnotobiotiques sur une période de quatre semaines.
Afin d’explorer l’activité métabolique de S. thermophilus in vivo et la réponse de l’hôte suite à l’arrivée de cette bactérie, nous avons :
i) suivi la colonisation du tractus digestif de rats gnotobiotiques par deux souches : S. thermophilus LMD-9 et S. thermophilus LMG18311;
ii) établi le profil protéique de S. thermophilus LMD-9 après son passage et sa survie dans le TD de rats mono-associés ;
iii) étudié l’effet de S. thermophilus LMD-9 et S. thermophilus LMG18311 sur l’épithélium colique et plus particulièrement sur les transporteurs de mono-carboxylates et sur les protéines du cycle cellulaire.
2.2 Méthodes
Des rats axéniques ont été inoculés (un seul gavage) avec du lait fermenté avec S. thermophilus (5 108 UFC/mL). L’implantation de cette bactérie a été suivie par dénombrement sur milieu gélosé pendant quatre semaines. Après passage dans le TD des rats, les protéines associées aux enveloppes bactériennes de S. thermophilus ont été extraites et identifiées par LC-MS/MS. Par une analyse protéomique comparative bidimensionnelle, nous avons comparé les protéines cytoplasmiques de S. thermophilus, après croissance en lait et après passage dans le TD. Le lactate, métabolite produit par la bactérie, a été dosé dans le contenu caecal et les fèces des rats.
L’étude de l’effet de S. thermophilus sur l’hôte a porté sur les cellules épithéliales coliques. Nous avons regardé l’aspect de cet épithélium colique et plus particulièrement la profondeur des cryptes sur des coupes histologiques. Nous avons ensuite déterminé l’expression des transporteurs de mono-carboxylates SLC16A1, SLC16A2 et SLC5A8 par RT- qPCR ainsi que les protéines d’arrêt du cycle cellulaires p21cip1 et p27kip1 par Western blot. 2.3 Principaux résultats
- S. thermophilus LMD-9 et LMG18311 s’adaptent au TD et le colonisent (108 UFC/g de fèces) après 4 semaines. La colonisation est progressive. Elle débute par une phase d’adaptation sur les deux premières semaines, une phase de croissance à partir de la deuxième semaine et une phase de maintient à partir de la troisième semaine.
- La comparaison des profils protéiques de S. thermophilus LMD-9 après croissance dans le lait et après passage dans le TD montre une différence d’abondance de certaines protéines. Après passage dans le tractus digestif, 11 protéines sont induites dont 8 impliquées dans le métabolisme du carbone. Les protéines réprimées sont impliquées dans des fonctions cellulaires de base.
- S. thermophilus LMD-9 et LMG18311 sont métaboliquement actifs dans le TD et induisent une glycolyse massive qui conduit respectivement à la production de 13.6 mM et de 10.2 mM de L-lactate dans le contenu caecal.
- Au niveau de l’épithélium colique, les ARNs messagers codant les transporteurs de mono- carboxylates SLC16a1 et SLC5a8 sont induits chez des rats mono-associés avec S. thermophilus LMD-9 (Ino –LMD9) par rapport à des rats axéniques (les facteurs d’induction étant respectivement de 2.2 et 1.7). La colonisation par S. thermophilus LMD-9 n’a pas
d’effet sur la morphologie des cryptes mais elle induit la production de la protéine d’arrêt du cycle cellulaire p27kip1 d’un facteur de 1.8 chez les rats Ino-LMD9 en comparaison avec des rats axéniques.
Le lactate pourrait être la molécule « signal » qui induit la production de la protéine d’arrêt du cycle cellulaire p27kip1. Cette hypothèse est confortée par les résultats d’expériences in vitro et d’expériences in vivo suivants :
- des co-incubations de cellules HT29 avec 20mM ou 50mM de lactate conduisent à l’induction de la protéine d’arrêt du cycle cellulaire p27kip1.
- la construction de modèles de rats monoassociés avec deux souches productrices de lactate (S. thermophilus LMD9 et S. thermophilus LMG18311) a permis d’observer une induction de la protéine d’arrêt du cycle cellulaire p27kip1.Contrairement à cela, dans les modèles de rats monoassociés avec deux bactéries non productrices de lactate (Bacteroides thetaiotaomicron et Ruminococcus gnavus) aucune induction de la protéine d’arrêt du cycle cellulaire p27kip1 n’est observée.
2.4 Conclusion
La caractérisation du métabolisme de S. thermophilus dans le tractus de rats gnotobiotiques a permis en premier lieu de constater que cette bactérie est métaboliquement active in vivo et en deuxième lieu de mettre en évidence l’intensification de son métabolisme glycolytique. Cette induction massive des protéines impliquées dans la glycolyse conduit à la production de L-lactate dans la lumière intestinale. La colonisation de S. thermophilus s’accompagne d’une induction des transporteurs de mono-carboxylates et la protéine d’arrêt du cycle cellulaire p27kip1. L’hypothèse avancée dans ce travail est que lactate produit in vivo par S. thermophilus est la molécule « signal » impliquée dans la réponse de l’hôte.
2.5 Participation à la réalisation de cette étude
Plusieurs résultats présentés dans l’article étaient produits avant mon arrivée, cependant j’ai participé au travail afin de mieux comprendre « l’effet » lactate.
J’ai contribué à l’étude de la réponse de l’hôte à la colonisation du TD par S. thermophilus. Plus précisément, j’ai comparé l’induction des transporteurs de mono- carboxylates (SLC16a1, SLC16a2 et SLC5a8) au niveau des cellules épithéliales coliques entre rats axéniques et rats mono-associés avec S. thermophilus par RT-PCR quantitative.
Ensuite, j’ai étudié l’effet de l’accumulation du lactate dans le colon chez des rats axéniques. D’une part, nous nous sommes posé la question de savoir si un apport exogène de lactate à des rats axéniques avait le même effet sur l’épithélium colique que le lactate produit par S. thermophilus. Ainsi, j’ai ajouté du lactate dans l’eau de boisson des rats axéniques pour assurer un apport régulier de lactate (concentration finale 50mM). Toutefois, je n’ai pas détecté de lactate dans les fèces ; celui-ci est probablement absorbé en totalité au niveau du TD.
D’autre part et afin de démontrer le rôle du lactate produit par S. thermophilus dans le TD, j’ai essayé d’invalider le gène codant la lactose déshydrogénase (Ldh) de S. thermophilus LMD-9. Je n’ai pas réussi à obtenir ce mutant car cette mutation est probablement létale (détails présentés dans les résultats complémentaires).