Immunomarquage

L'implantation à long terme d'électrodes pénétrantes peut induire des réactions tissulaires complexes responsables d'une dégradation des signaux électrophysiologiques et d'une augmentation de l'impédance des électrodes. Plusieurs réactions cellulaires peuvent apparaître : l'activation de la microglie, la formation d'une cicatrice gliale sur le dispositif ainsi que l'absence ou la perte des neurones à proximité de l'implant (mort cellulaire).

Un des challenges majeurs est de comprendre les modifications cellulaires autour de l'implant au cours du temps. L'objectif de ce travail est d'étudier l'interface implant/tissu intact. Cela nécessite de développer une méthode permettant de récupérer les tissus sans faire bouger les électrodes et d'optimiser des immunomarquages permettant d'étudier la réaction du cerveau aux implants. L’objectif est de marquer les cellules pouvant nous donner des indications quant à l’intégration de l’implant dans le cortex. Or pour arriver à marquer et observer ces cellules il faut au préalable extraire le cerveau du crane du rat. Il faut ensuite pouvoir réaliser de fines tranches de cerveau. Une fois cela effectué, le marquage est réalisé puis les tranches sont observées au microscope bi-photon. Ce travail a été réalisé par Anne Quesnel-Hellmann.

Après une certaine période de temps après l’implantation des électrodes, le cerveau du rat est prélevé afin d’analyser le comportement des cellules autour de l’implant. La microglie, les astrocytes ainsi que les neurones sont les trois grands types de cellules que nous observons. Après fixation du cerveau au PFA et extraction du cerveau (voir annexe 7), le cerveau est coupé en tranches de 100 µm d’épaisseur grâce à un vibratome. Ces tranches sont ensuite marquées avec différents anticorps primaires. Des anticorps secondaires correspondants sont ensuite utilisés afin de pouvoir visualiser les cellules au microscope à fluorescence puis au confocal (annexe 7). Des tests sur un morceau de SU-8 aux grandes dimensions (1mmx2mmx12µm) implanté pendant 8 semaines dans le cortex de rat ont montré de premiers résultats (figure 99). Des astrocytes sont présents et forment un « tapis » autour de l’implant : cette cicatrice gliale est à éviter avec les implants car elle peut se placer au niveau des électrodes et empêcher le contact entre les électrodes et les neurones.

La cicatrice observable autour du morceau de SU-8 peut être dû à sa taille importante. Les fils de l’implants insérés dans le cortex sont beaucoup plus petits ce qui pourrait modifier la réponse immunitaire.

Des premières coupes d’un cerveau de rat implanté grâce à la méthode du véhicule de transport montre une certaine nécrose autour des fils (voir figure 100). Cette implantation était très profonde et a eu lieu bien au delà du cortex.

Figure 100 : Coupe de cerveau de rat implanté, avec un fil entouré de de tissu nécrosé Figure 99 : Histologie Ex Vivo 8 semaines après

l’implantation d’un morceau de SU-8 de dimension 1x2x0,012 mm

Figure 101 : a : Marquage de la microglie (en rouge) et des astrocytes (en vert) d'une coupe de cerveau de rat implanté avec un tentacule avec des fils droits. La flèche montre une cicatrice. b : Marquage de la microglie (en rouge) d'une coupe de

cerveau de rat implanté avec les fils ondulés d’un tentacule.

D’autres coupes et marquages ont été réalisés 8 semaines après implantation d’un autre rat. La figure 101 montre la présence de macrophage (en rouge) autour de l’implant. Sur la figure 101a une cicatrice (en vert) est aussi observable autour de l’implant. On suppose que la méthode d’implantation a créé certains dommages. Il reste à déterminer quelles sont les raisons précises de la présence importante de microglie et d’astrocytes autour de l’implant. Des marquages seront réalisés chez d’autres rats implantés plus longtemps afin d’observer l’évolution de l’implant et de son environnement à moyen/long terme. La figure 101b permet d’observer les fils de SU-8 dans une coupe de cerveau implanté. La présence importante de macrophages autour des fils laisse présager une forte réponse immunitaire.

3.4 Perspectives

 Méthode d’insertion de l’implant

Les pointes en PLGA réalisées ne sont pas encore assez fines pour permettre une bonne implantation. De futurs tests de la gravure du PLGA par plasma seront menés. La résine sera remplacée par un film photosensible. Le film sera collé sur le wafer et ne nécessitera aucun recuit qui pourrait faire fondre le PLGA et créer un mélange PLGA/résine comme lors des essais précédents. Le temps de gravure sera découpé, une pause d’une minute entre chaque gravure d’une minute permettra d’éviter une hausse trop importante de la température et par conséquent la déformation du PLGA.

La soie photosensible est un autre matériau biodégradable qui pourra être testé. Les méthodes utilisées pour découper ou graver le PLGA pourront être appliquées sur la soie non photosensible. La soie photosensible devrait pouvoir permettre de créer des pointes sur le wafer avant décollement de l’implant. La définition et le positionnement des pointes devraient alors être très bons grâce à la précision de la photolithographie (annexe 2).

Afin de faciliter la manipulation lors de l’insertion des pointes avec le véhicule de transport, des fils rigides et droits de faibles diamètres pourraient être testés. De longs fils rigides (3 cm) collés grâce au PEG aux extrémités des tentacules nous laisseraient envisager plus facilement l’utilisation de système d’insertion automatique. En effet, pour améliorer la précision et la répétabilité des implantations, les

fils permettant d’insérer les électrodes seront contrôlés grâce à un descendeur. Le descendeur permettant d’effectuer l’insertion à différentes vitesses, une étude sur la vitesse d’insertion sera aussi réalisée dans le futur. De plus, un support de l’implant plus rigide devrait aussi permettre des implantations plus précises.

 Enregistrements in vivo

Les enregistrements effectués sur les différents rats ont permis d’enregistrer des potentiels d’actions ainsi que des champs de potentiels locaux. Les potentiels d’actions n’ont été enregistrés que sur quelques électrodes d’un implant. D’autres implantations suivront suite aux changements apportés lors de la chirurgie comme le retrait de l’hémopatch (annexe 6) ou à l’amélioration de la connexion entre l’implant et le Cicor.

Afin de valider le bon fonctionnement du système, il est envisagé d’implanter des rats sur plusieurs mois (3-8 mois) et de suivre l’évolution des signaux au cours du temps. De plus, nous souhaitons réaliser les implantations dans des zones motrices afin d’observer la correspondance entre les enregistrements et les mouvements du rat.

 Immunomarquage

Les premiers résultats préliminaires de l’immunomarquage ont permis d’établir la présence d’astrocytes et de macrophages sur le lieu de l’implantation (cicatrice) voire même de la nécrose. Les causes de la nécrose et de la récation immunitaire importante peuvent être multiples. Un geste chirurgical trop invasif, une implantation sur un vaisseau sanguin, le fait que le fil d’implantation n’ait pas été autoclavé ou encore l’utilisation d’un hemoptach pour reconstruire la dure mère (voir annexe 6) (normalement conçu pour reconstruire la dure mère humaine) sont des causes possibles de la nécrose. Ces premières coupes de cerveau ne nous permettent pas de conclure complètement sur la nature de la réponse du tissu. Afin de comprendre les raisons de la nécrose et du réveil de la réponse immunitaire d’autres rats ont été implantés.

Chapitre 4 : Caractérisation par

fluorescence des limites d’injection de

charge des microélectrodes

Ce chapitre traite d’une méthode de caractérisation des électrodes de stimulation par fluorescence. Cette méthode permet de visualiser les changements de pH autour d’une électrode lorsqu’un courant de stimulation est injecté. Différents matériaux d’électrodes ont été caractérisés et testé avec cette méthode. Les performances en stimulation de ces matériaux sont comparées. La méthode par fluorescence est comparée à la méthode par voltamétrie cyclique. Pour finir, une étude sur la densité de courant lors de la stimulation permet de comprendre une des voies d’optimisation de la stimulation.