Immunofluorescence sur chromosomes

L’immunofluorescence est une technique qui permet la visualisation d’une protéine présente sur un objet fixé et ce par le même principe que celui du western blot : la reconnaissance anticorps/antigène.

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Prroottooccoolleeddeepprrééppaarraattiioonnddeessllaammeessddeecchhrroommoossoommeess

i. Des « aliquots » de solution de chromosome sont déposés dans une solution de fixation (3 % PFAfinal ; qsp PBS 1X) à 4 °C pendant 15

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,

ii. Le mélange est ensuite déposé sur des lames fonctionnalisées par du

Vec abond™ (Vector Laboratories) selon le protocole fourni par le fabricant de ce produit. A l’aide de ce produit, les lames de verre acquièrent une très grande affinité pour l’ADN. Le mélange est déposé une heure à 4°C afin de laisser les chromosomes sédimenter et se fixer sur les lames.

iii. L’ensemble lame + chromosomes est ensuite plongé dans une solution de fixation (4 % PFA ; qsp PBS 1X) à 4 °C pendant 15 minutes.

iv. Le tout est ensuite rincé deux fois 5 minutes dans du PBS 1X à 4 °C.

v. L’anticorps primaire est ensuite dilué (au 1/200^ème pour la

topoisomérase II et au 1/300^ème pour XCAP-C) dans une solution (5 % sérum d’agneau (sérum d’agneau, Invitrogen™ # 16070-096) ; 0,1 % Triton X100 ; 0,5 % SAB ; qsp PBS 1X). La solution d’anticorps est ensuite déposée une heure à 37 °C sur les lames de manière à recouvrir complètement le précédent dépôt de chromosomes (cf. ii). vi. Les lames sont ensuite rincées trois fois 10 minutes à 4 °C dans une

solution de même composition que celle qui sert à diluer l’anticorps (cf. v ).

vii. L’anticorps secondaire est ensuite dilué au 1/300^ème dans la même solution qu’auparavant (cf. v) et déposé sur les lames 45 minutes à 37 °C. Cet anticorps secondaire est couplé à de la fluorescéine.

viii. Une étape de lavage identique au iv ci-dessus est ensuite réalisée. ix. Une solution contenant un fluorochrome (Hoechst 33258, 5.10^-5 M)

spécifique de l’ADN dilué dans une solution (200 mM sucrose ; 7,4 %

formaldéhyde ; 10 mM Hepes pH 7,5 ; qsp H20 ∆ ) permettant de

diminuer le photoblanchiment du fluorochrome est ensuite déposée sur les lames. Le Hoechst 33258 est excité à une longueur d'onde de 345 nm (UV) et il fluoresce à 450 nm.

Immunofluorescence sur chromosomes

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Obbsseerrvvaattiioonnssoouussmmiiccrroossccooppeeeettpprriisseedd’’iimmaaggee

Les chromosomes fixés sur les lames et marqués conjointement par le Hoechst et la fluorescéine sont observés à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Zeiss, Axiophot). Ce microscope est équipé d’une caméra CCD refroidie (- 40 °C). Cette dernière est pilotée par le logiciel Argus 50 (Hamamatsu Photonics). La source lumineuse est une lampe à vapeur de mercure HBO 100W.

L’objectif utilisé est un objectif à immersion à huile de grossissement 63 X (NA = 1,25) mis en série avec une lentille intermédiaire (optovar) de grossissement 1,25 X. Les images acquises sont ensuite transférées sur ordinateur afin d'y être traitées et analysées à l’aide d’un logiciel d'analyse d'image (CytoFISH) développé par Y. Usson⁴.

Selon le fluorochrome, Hoechst ou fluorescéine, des filtres d’excitation et d’émission sont ajoutés sur le montage.

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Dans notre cas, le but de ces expériences d’immunofluorescence est de voir correctement la présence et l’emplacement sur le chromosome de certaines protéines (au cas où la localisation de ces dernières serait globalement affectée). Comme il est difficile de voir ceci sur une image native (i.e. sans traitement préalable), il est donc nécessaire d’effectuer un traitement d’image afin de pouvoir obtenir de manière satisfaisante ces informations.

Evidemment, lors d’un traitement d’image, une place est laissée au libre jugement de l’opérateur qui effectue le traitement. Afin de refléter au mieux la réalité, nous avons appliqué toujours le même protocole de traitement en nous attachant très fortement à ce que le résultat reproduise le plus fidèlement possible la ‘réalité vue sous le microscope’.

Ce traitement d’image effectué à l’aide du logiciel CytoFish se déroule en trois parties successives décrites ci-dessous.

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i. La suppression du bruit de fond

L’imagerie en fluorescence a pour inconvénient de présenter un rapport signal sur bruit faible. La majorité des fluorochromes habituellement utilisés en biologie présentent un faible rendement quantique. De plus, des sources d’artefacts comme le bruit de fond de l’électronique d’acquisition ou l’autofluorescence faible de certaines protéines se rajoutent et rendent nécessaire ce traitement. Ce processus de filtrage logiciel a donc été utilisé pour éliminer au mieux ces différents bruits de fond.

ii. La correction de dynamique

Les images obtenues par une caméra CCD telle que celle que nous utilisons sont codées sur 8 bits (2⁸ niveaux de gris), la valeur du niveau de gris étant d’autant plus haute que la luminosité de l’objet est grande. Les 256 niveaux de gris que possède ce type d’image permettent un certain étalement de la dynamique. Or, l’élimination du bruit de fond ou un faible étalement de la dynamique initiale de l’image ne permet pas de profiter pleinement de cette gamme. Une correction logicielle de ce phénomène permet donc d’améliorer grandement le contraste.

iii. Le déflouage des images

En optique, l'image d'un objet ponctuel apparaît comme une tache plus floue (taches d’Airy) en raison du phénomène de diffraction de la lumière. Une technique de traitement d’image, relativement souvent utilisée en microscopie, permet de réduire ces effets de diffraction : la déconvolution.

Cette étape permet de nettement augmenter la lisibilité de l’image, mais il est nécessaire de l’utiliser avec beaucoup de précautions car le risque de création d’artefacts est relativement grand.

Dans notre cas, nous utilisons les réglages du logiciel Cy oFish suivant pour la phase de déconvolution des images :

• Algorithme : Meinel. •

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L'expérience d'étirement

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10. L'expérience d'étirement

La technique d’étirement de chromosome est vraiment au cœur de ce travail. Quoique le principe de cette expérience soit relativement simple à comprendre (i.e. étirer un chromosome et mesurer la force nécessaire pour l’allonger), sa réalisation est beaucoup plus compliquée. Au cours de ce chapitre, je vais essayer d’être le plus exhaustif possible car un détail minime non respecté peut entraîner l ‘échec de l’expérience.

a. Généralités sur le montage expérimental

Le montage est sensiblement le même que dans Houchmandzadeh et Dimitrov, 1999. Brièvement, sous un microscope inversé (Olympus IX70) est disposé sur une platine (860-C2, NEWPORT) un réservoir contenant une solution aqueuse dans laquelle des chromosomes sont en suspension. Deux micromanipulateurs sont disposés de chaque côté du réservoir et sont fixés sur la platine. Ces deux micromanipulateurs portent chacun une micropipette. Chaque micropipette est capable de saisir le chromosome soit en l’aspirant, soit en le « collant » par l’intermédiaire d’anticorps adsorbés à sa surface.

Dans le cas de l’aspiration, un dispositif de surpression (IM-300, Narishige ; gaz vecteur : azo e U) et de dépression (pousse seringue de fabrication maison) sont ajoutés au montage. Ces dispositifs de régulation de la pression sont connectés avec l’intérieur de chacune des pipettes.

L’image obtenue par l’optique du microscope est d’abord recueillie par une lentille X1,25 (présente dans le tube latéral de branchement de la caméra) puis est collectée par une caméra CCD (VHR-2000, Micam, 512 X 512 pixels, 8 bits, non refroidie)

qui achemine l’image jusqu’à un magnétoscope (AG-TL700, Panasonic, S-VHS).

Le magnétoscope achemine l’image vidéo provenant de l’expérience en cours ou d’une expérience enregistrée à un micro-ordinateur (Gateway 2000, Gateway). Via une carte d’acquisition (DT-3155, Datatranslation®) présente dans l’ordinateur et à l’aide d’un logiciel conçu par B. Houchmandzadeh⁵, la vidéo est numérisée. L’exploitation des résultats se fait ensuite informatiquement.

Figure VI.3 : Schéma général du montage expérimental

(© Sébastien Almagro, 2003)

Sous un microscope inversé est disposé un réservoir contenant une solution de chromosome. Deux micromanipulateurs tiennent deux micropipettes qui plongent dans ce réservoir. Ces deux micropipettes permettent d’attraper le chromosome par ses deux bouts. L’expérience est filmée par l’intermédiaire d’une caméra CCD. Le film de l’expérience est enregistré sur un magnétoscope S-VHS. Le traitement des résultats (images) de l’expérience est réalisé sur un ordinateur équipé d’une carte de numérisation vidéo.

L’ensemble du montage, hormis la partie informatique et stockage de l’image, est isolé des vibrations par une table antivibratoire (TLC, Integrated Dynamics Enginee ing)r .

L'expérience d'étirement

b. Isolation vibratoire du montage

Comme cela va être montré plus loin dans cette thèse, nous avons décidé d’étudier l’élasticité des chromosomes avec la meilleure résolution possible (et en concordance avec nos moyens !). Ce choix est lourd de conséquences concernant la manière doit être disposé le montage expérimental. Pour bien se rendre compte de la sensibilité de notre expérience, si nous utilisons une pipette de constante de ressort égale à 50 pN.µm^-1, une valeur assez courante dans nos expériences, une force égale à 50 pN la défléchira de 1 µm. 50 pN représente la force exercée par la terre sur une goutte d’eau de 5.10^-3 µl (5.10^-9 litre) !

Il est donc nécessaire d’isoler au maximum le montage des diverses vibrations présentes dans le bâtiment. Dans ce dessein, l’ensemble du montage est installé sur une table antivibratoire. Ce type de table est posé sur quatre vérins à air comprimé. La pression dans chaque vérin est la plus petite possible afin de transmettre un minimum les vibrations au montage, mais est suffisante pour assurer la suspension de la table d’un demi-centimètre environ. De plus, tous les divers câbles électriques ou autres tuyaux reliant le montage à l’extérieur de la table sont soigneusement fixés.

c. Réservoir qui accueille la solution de chromosomes

Un moyen d’obtenir des chromosomes facilement accessibles est de les incuber dans un réservoir. La solution qui permet l’assemblage des chromosomes et qui les contient pouvant être diluée par du tampon (Houchmandzadeh et Dimitrov, 1999), nous déposons les chromosomes dans un réservoir.

Ce réservoir (cf. Figure VI.4) est construit à partir d’un joint torique (Øint = 13 mm, Øext= 19 mm) collé (colleDow Corning® 732) sur une lamelle de verre (50 mm x 26 mm x 170 µm). Afin que le joint soit bien collé à la lamelle, une presse d’environ 500 g comprime le joint sur la lamelle pendant le séchage de la colle. A noter que les vapeurs de cette colle peuvent détruire les chromosomes. Il est donc impératif d’attendre que le solvant de la colle soit complètement évaporé, soit environ une à deux heures d’attente avant de déposer la solution de chromosomes dans le

Les chromosomes sont déposés dans le réservoir selon le protocole suivant :

i. 3,8 µl de Hoechst 33258 à 5.10^-5 M dans du tampon EB sont

déposés dans le réservoir. A noter que lors de l’expérience d’étirement de chromosomes, jamais du fixateur n’est ajouté au fluorochrome.

ii. 5 µl de solution de chromosomes sont ajoutés au Hoechst. Le

mélange chromosomes/Hoechst 33258 est laissé 5 à 7 minutes seul afin que le Hoechst marque correctement les chromosomes.

iii. 300 µl de tampon est ajouté au mélange. La composition du tampon peut varier : EB, EB sans Mg⁺⁺ ou EB sans Mg⁺⁺ à 150 mM NaCl. Si le tampon contient du NaCl, un temps d’attente de 30 minutes entre l’ajout du tampon et l’étirement est respecté. Au cours de ce temps, la topoisomérase II (entre autres) est enlevée du chromosome. De manière générale, il est nécessaire d’attendre un peu que les chromosomes sédimentent dans le réservoir car cela facilite ensuite

leur localisation et leur saisie (cf. chapitre « Attraper un

chromosome à l’aide d’une micropipette »).

Figure VI.4 : Réservoir qui contient la solution de chromosomes

(© Sébastien Almagro, 2003)

La figure de gauche est une vue par la tranche du réservoir et la droite une vue de dessus. Un joint thorique est collé à la surface d’une lamelle. Ce montage permet de créer un réservoir capable d’accueillir la solution de chromosomes.

L'expérience d'étirement

d. Les micropipettes

Les micropipettes, c’est-à-dire des capillaires dont le diamètre à l’extrémité a été rendu très petit, jouent un rôle central dans l’expérience d’étirement de chromosomes. Elles vont non seulement permettre d’attraper le chromosome mais aussi de mesurer la force nécessaire pour l’étirer. J’emploierai au cours de ce texte de manière indifférente les termes de pipette et micropipette.

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Meessuurreerruunneeffoorrcceeààll’’aaiiddeedd’’uunneemmiiccrrooppiippeettttee

Une pipette peut être considérée comme un ressort. Si une force est appliquée sur celle-ci, elle est capable de se défléchir. Tout comme un ressort, son allongement est régi par la relation suivante :

F =K . X