Immobilisation des cellules

L’intégration de cellules dans un biocapteur nécessite l’immobilisation rigoureuse de cellules entières. Comme pour les biocapteurs moléculaires, l’étape d’immobilisation de l’élément de reconnaissance est très importante car c’est elle qui va gouverner la performance globale du biocapteur, c'est à dire ses performances en terme de temps de réponse, de spécificité, de sélectivité, de sensibilité et de fiabilité. Le but est d’accrocher des cellules intactes sans altérer leurs propriétés.

Les métaux sont souvent utilisés comme support, notamment les métaux nobles. En effet, l’or, l’argent et le platine résistent à la corrosion et à l’oxydation faisant d’eux des matériaux idéaux pour les capteurs. Ayant une très bonne conductivité, l’or est très couramment employé. Les nanoparticules de métaux tel que l’or sont également des outils efficaces pour l’immobilisation de biomolécules [De la Fuente, JM. et al., 2006, Gu, HY. et al., 2001, Tang, D. et al., 2007] et de cellules [Tang, D. et al., 2007].

3.3.1 Greffage des cellules par le biais d’interfaces chimiques

Cependant sauf exception, comme dans le cas des cellules adhérentes, les cellules n’ont aucune affinité pour les surfaces métallisées ce qui nécessite une fonctionnalisation de surface par le biais d’interface chimique. Cette étape consiste à déposer sur la surface des fonctions chimiques ayant une affinité avec des biomolécules capables de fixer la cellule. Les principales fonctions chimiques permettant le greffage de biomolécules sont les fonctions amines et carboxylates.

Les premiers travaux de fonctionnalisation de surface employaient des interfaces chimiques épaisses comme des polymères déposés par électropolymérisation sur des surfaces tels que la polyaniline, des polyphénols, ou des polythiophènes [Barlett, PN. et al., 1993]. D’autres films denses ont également été utilisés tels que des moulages à base de glutaraldéhyde, des immobilisations covalentes à l’aide de dicyclohexyle carbodiimide, ou des couches de polylysine [Davis, F. et al., 2005].

Depuis plusieurs années, la majorité des recherches dans le domaine du greffage de biomolécules sont réalisées sur des couches plus minces permettant une meilleure diffusion à travers le film [Davis, F. et al., 2005]. Une grande variété de matériaux peut offrir jusqu’à l’épaisseur d’une seule molécule :

 Des films à base de polyélectrolytes permettent l’adsorption de biomolécules par l’intermédiaire d’interactions électrostatiques pour former des monocouches [Davis, F.

et al., 2005, Decher, G. et al., 1992]. Des érythrocytes ont été incorporés dans une

matrice de polyélectrolyte à base de polypyrrole grâce à l’affinité du polymère avec l’antigène Rh (D) présent dans la membrane cellulaire, permettant ainsi l’élaboration d’un nouvel outil pour la détermination du groupe sanguin [Campbell, TE. et al., 1999].

 Les monocouches auto-assemblées « SAMs » (Self Assembled Monolayers) sont appropriées pour l’immobilisation de biomolécules sur des surfaces [Yang, L. et al., 2005]. Elles sont utilisées pour l’immobilisation de nombreuses biomolécules, comme des protéines [Briand, E. et al., 2006, Liu, GY. et al., 2002, Wang, ZH. et al., 2006], des antigènes/anticorps [Dong, Y. et al., 2000, Hirlekar Schmid, A. et al., 2006], la polylysine [Jordan, CE. et al., 1994]. Ce sont des molécules composées de chaînes carbonées plus ou moins longues, avec à une extrémité un atome qui se lie spontanément à la surface, et de l’autre un groupement fonctionnel compatible avec des biomolécules. Les atomes tels que l’azote ou le soufre peuvent s’adsorber spontanément sur des métaux nobles par chimisorption et forment respectivement des liaisons Au-N et Au-S (Figure 1.9) [Boubour, E., 2000]. Ces molécules ont la capacité de former spontanément une monocouche auto-assemblée dans laquelle les molécules sont organisées en raison des interactions et à une forte cohésion entre les chaînes (liaison de Van der Waals), donnant lieu à un film anisotrope stable et ordonné. Une monocouche auto-assemblée organisée formée sur un support solide permet l'obtention d'une surface organique dense, homogène et ayant des paramètres bien définis à la fois chimiquement et structurellement. La préparation des SAMs est simple et rapide. Elle se fait par simple immersion de la surface dans une solution contenant le groupement fonctionnel [Kanta, A. et al., 2006]. Les systèmes les plus utilisés sont les monocouches auto-assemblées d’alkanethiols [Yang, L. et al., 2005]. Néanmoins, d’autres groupements existent tels que les disulphides, les thiones et les thioesters qui s’adsorbent sur les métaux nobles [Davis, F. et al., 2005]. L’utilisation de thiols mixtes, constitués d’un mélange de deux thiols avec des fonctions terminales différentes, permet d’éviter les adsorptions non spécifiques en diluant la quantité de groupements fonctionnels [Lee, JW. et al., 2005].

Figure 1.9. Dépôt de monocouches auto-assemblées de thiols sur un support.

S R S R S R S R S R S R S R

Adsorption par chimisorption Chaînes carbonées Groupements fonctionnels S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R

Adsorption par chimisorption Chaînes carbonées

Les surfaces, ainsi fonctionnalisées par une interface chimique, peuvent être modifiées à l’aide d’éléments biologiques. Le récepteur peut ainsi recevoir une multitude d’éléments de reconnaissance telles que des enzymes, des anticorps, de l’ADN ou des microorganismes capables de reconnaître leur analyte spécifique.

De nombreuses recherches ont abouti à l’utilisation d’interfaces chimiques pour l’immobilisation de cellules. Par exemple, des travaux ont été réalisés sur l’apoptose de cellules endothéliales après stimulation par des endotoxines à l’aide d’un système d’accroche complexe à base de polymère. Du polystyrène déposé sur une couche de thiols permet l’immobilisation de fibronectine utilisée comme élément biologique permettant l’accrochage de cellules endothéliales. Ce système est présenté comme un modèle de substrat reproductible pour l’étude d’interactions cellules/matériau [Bouafsoun, A. et al., 2008].

3.3.2 Inclusion des cellules dans une matrice

D’autres travaux consistent à immobiliser les cellules, non plus par greffage, mais par inclusion dans des gels. Ainsi, une matrice inorganique translucide, obtenue par un procédé sol-gel sur un support en silice, a été imaginée pour l’immobilisation de cellules végétales (Chlorella vulgaris) pour une étude par fluorescence [Nguyen-Ngoc, H. et al., 2007]. Un biocapteur a été élaboré avec un gel d’agarose pour immobiliser des bactéries (Escherichia

coli K-12) afin d’étudier des agents biologiques actifs [Bettaieb, F. et al., 2007]. Enfin, des

travaux ont utilisé un disque d’éponge de diméthyle silicone (ImmobaSilTM

) pour l’immobilisation de cellules (Rhodococcus ruber NCIMB 40457) pour la détection d’acrylonitrile [Roach, PCJ. et al., 2003].

Les biocapteurs cellulaires possèdent un récepteur et un transducteur. Un biocapteur cellulaire fonctionne avec deux étapes de transduction. Les cellules servent de premier transducteur en convertissant l’analyte détecté en une réponse cellulaire. Le second transducteur converti ensuite cette réponse cellulaire en un signal électrique qui est analysé [Park, TH. et al., 2003]. Comme dans le cas des biocapteurs moléculaires, différentes méthodes (optique, calorimétrie, piézoélectricité, électrochimie) permettent de transcrire les réponses cellulaires en un signal quantifiable.