A Images instantanées de cellules uniques avec marqueurs phénotypiques

Pour faire le lien entre le protéome ou le transcriptome d’une cellule et sa morphologie à un instant donné, il existe plusieurs méthodes comme l’hybridation fluorescente in situ (ARNm FISH) pour la quantification des ARNm ou la cytométrie en flux en images (CFI) pour la quantification des protéines. Seule la cytométrie en flux en images sera détaillée ici car c’est la technologie que j’ai utilisé au cours de ma thèse pour analyser la morphologie d’un très grand nombre de cellules CD34+ et pour faire le lien entre leur morphologie et la localisation spécifique d’une protéine membranaire : le CD133.

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Brièvement, l’ARNm FISH est une technologie qui permet de compter et de marquer les molécules d’ARNm de cellules fixées ou de tissus grâce à des sondes fluorescentes spécifiques (Cui et al., 2016; Kanter and Kalisky, 2015). Elle est souvent utilisée pour analyser quelques gènes exprimés et n’est donc pas appropriée pour analyser un grand nombre de gènes (Akel et al., 2000; Levsky et al., 2002; Visconti et al., 2006; Zeng et al., 2005). C’est pourquoi, elle est souvent complémentaire à la technique de RT-qPCR qui elle permet d’analyser et de quantifier des centaines de gènes simultanément dans une cellule.

La CFI, contrairement à l’ARNm FISH, est une technologie qui permet d’analyser à la fois la morphologie et les protéines des cellules uniques. C’est une technologie récente, à haut débit qui permet d’analyser le protéome et sa localisation dans des milliers de cellules. L’imagerie à l’échelle de la cellule unique à haut débit est une technologie essentielle pour l’étude de la biologie moléculaire et cellulaire. La CFI combine les capacités d’imagerie d’un microscope à l’échelle de la cellule unique avec les capacités à haut débit d’un cytomètre en flux classique (Han et al., 2016).

Le principe est le suivant : les cellules individuelles en suspension marquées par des sondes fluorescentes ou non sont introduites dans un système fluidique où elles sont focalisées dans un flux cellulaire. Les cellules passent ensuite devant une source de lumière à diode électroluminescente lumineuse et devant au moins un laser qui va créer des signaux de lumière transmise et dispersée ainsi que des signaux fluorescents (Wilkins et al., 2017). Avec un CFI, les signaux lumineux, transmis, dispersés et fluorescents sont collectés par une lentille d’ouverture numérique élevée (objectif 20x, 40x et 60x) et décomposés en champs spécifiques en fonction de leurs longueurs d’onde. Ces intervalles de longueurs d’onde sont ensuite focalisés dans différents canaux d’une caméra de dispositif à transfert de charge (caméra CCD) dans un champ spectral compris entre 430 et 800 nm. Ces canaux capturent des sous images qui peuvent être combinées pour analyser la co-localisation des signaux (Figure 38). L’avantage d’utiliser un CFI comparé à un cytomètre en flux classique est la possibilité d’utiliser des algorithmes d’analyse d’images sur un grand nombre d’échantillons simultanément. Une fois établie, les modèles d’analyses peuvent être facilement réutilisables et partagés entre les systèmes similaires. Cette approche a permis d’identifier un sous ensemble de cellules myéloïdes dans la MO qui interagit avec les CSH et induit la sur-régulation de COX-2 sous le stress (Ludin et al., 2012).

Elle a aussi permis de découvrir que les cellules CD34+ issues de sang de cordon étaient plus résistantes à l’apoptose endogène et induite par irradiation que les lymphocytes CD34- (Durdik et al., 2017). Enfin, la CFI a aussi permis d’étudier en profondeur les

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mégacaryocytes, cellules très rares dans la MO (McGrath, 2015). La forme, la taille et la teneur élevée en ADN de ces cellules sont très similaires à des amas de cellules. En utilisant la forme, la texture et le chevauchement des signaux fluorescents, cette équipe a pu limiter l’analyse aux mégacaryocytes en éliminant les contaminants.

Figure 38 : Images obtenues avec un cytomètre en flux en images (ImageStream®).

Cellules CD34+ issues de sang de cordon, marquées avec des marqueurs métaboliques. De gauche à droite : image en lumière blanche, marquage avec Glut1 (Glucose Transporter 1), marquage avec ASCT2 (Solute carrier family 1 member 5), marquage avec FLVCR1 (Feline Leukemia Virus Subgroup C Cellular Receptor 1) et superposition des images pour voir la co-localisation des marqueurs.

Il faut toutefois noter que la CFI à l’heure actuelle ne peut pas remplacer la microscopie confocale due à sa plus faible résolution mais qu’elle est complémentaire à cette technologie de par son nombre important de cellules analysables simultanément.

Depuis quelques années, la cytométrie de masse peut aussi être couplée à de l’imagerie. Pour gagner en informations 3D, Giesen et al. ont couplé les méthodes d’immunohistochimie et d’immunocytochimie avec la cytométrie de masse CyTOF (Giesen et al., 2014). Cette méthode a l’avantage d’utiliser les mêmes équipements que la cytométrie de masse et permet de prendre des images de cellules marquées simultanément avec une trentaine de protéines. Grâce à cette nouvelle approche, ils ont pu ainsi imager des échantillons de cancer du sein humain ce qui leur a permis de délimiter les sous-populations cellulaires, les interactions cellule-cellule et de mettre en évidence l’hétérogénéité tumorale.

Une autre approche, appelée imagerie à faisceau ionique multiplexée, utilise un faisceau d’ions pour libérer les rapporteurs d’ions métalliques qui sont quantifiés par le spectromètre de masse (Angelo et al., 2014). Cette technologie est capable d’analyser jusqu’à 100 cibles simultanément sur une échelle de 5 log. Bien que cette méthode nécessite un équipement plus spécifique, elle offre une haute sensibilité et une grande résolution.

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Les images prises instantanément donnent des informations sur la localisation de l’expression des gènes et des protéines dans la cellule et sur l’hétérogénéité de la morphologie d’une population cellulaire. De par son caractère instantané, elles ne donnent qu’une partie des informations et ne révèlent pas la dynamique morphologique des cellules. L’idéal (mais malheureusement impossible) serait donc de pouvoir observer in vivo les fluctuations de l’expression des gènes et des protéines au cours de la vie de la cellule afin de comprendre l’engagement des cellules dans les différentes voies de différenciation. Il est néanmoins possible de suivre le déplacement de la cellule in vitro et d’observer sa dynamique morphologique au cours du temps grâce à la microscopie en TL.

V.B Suivi temporel de la dynamique phénotypique des cellules uniques in vitro :