Imagerie de fluorescence

Des radioisotopes tels que le fluor 18 (¹⁸F) ^[145], le cuivre 64 (⁶⁴Cu) ^{[142, 146]} le ^99mTc

[118, 147]

ou encore le carbone 14 (¹⁴C) ^[148] ont également été fixés aux QDs, ainsi que des particules paramagnétiques comme le gadolinium (Gd) ^{[141, 149-151]} ou l’hydrogène 3-cholesteryl oleyl éther (³H-cholesteryl oleyl éther) ^[152]. Ces particules ainsi appelées hybrides ou parfois sondes bi- ou encore multi-modales ont été développées et permettent de réaliser de l’imagerie multimodale : fluorescence couplée à de l’imagerie nucléaire ou à de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et ainsi obtenir des informations supplémentaires par rapport à de l’imagerie de fluorescence seule, par exemple.

II.3. Techniques de quantification

Différentes techniques sont utilisées pour quantifier les QDs et de nouvelles se développent. In vivo, les techniques employées permettent une quantification souvent relative (recueil de signaux émis) et parfois absolue (valeur de concentrations) des QDs, alors que ex

vivo, les méthodes utilisées rendent toujours possible leur quantification absolue ^[122].

II.3.1. Quantification in vivo

II.3.1.1. Imagerie de fluorescence

Les techniques d’imagerie optique attirent de plus en plus l’attention pour des applications médicales, dues en particulier à leurs procédures non-invasives, leur haute résolution temporelle et leur coût relativement bas. L’imagerie de fluorescence dans les longueurs d’onde du visible est largement utilisée en routine pour de la microscopie conventionnelle ou intravitale ^[153].

L’inconvénient majeur de cette technique pour l’imagerie in vivo est sa profondeur de pénétration limitée dans le visible, du fait de la forte absorption et diffusion de la lumière dans les tissus biologiques. En effet, pour étudier et suivre les signaux biologiques sur le corps

entier des animaux, la lumière incidente doit traverser les tissus biologiques d’au moins quelques millimètres. Pour pallier à cette contrainte, et rendre possible l’imagerie sur animaux vivants, il est recommandé de travailler avec une fenêtre spectrale dans le proche infrarouge (PIR) entre 700 et 900 nm, dans laquelle les principaux chromophores endogènes incluant l’hémoglobine, l’eau ou encore la mélanine absorbent beaucoup moins (Figure 14).

Figure 14. Spectres d’absorption de l’eau et de l’hémoglobine, principaux composés des tissus biologiques. ^[154]

L’équipe de Weissleder a été la première à développer et tester un système d’imagerie de fluorescence 2 dimensions expérimental sensible aux sondes émettant dans le PIR et dédié au petit animal ^[155]. En 2002, le groupe de Frangioni a introduit le concept d’un système d’imagerie PIR peu coûteux, sans danger et facile d’utilisation pour les gros animaux tels que le cochon ^[156], puis a développé cet imageur qui permet maintenant au chirurgien de « voir » simultanément l’anatomie et la fluorescence émise par les marqueurs pendant l’opération, de façon non-invasive, avec une forte résolution spatiale et en temps réel ^[157]. En 2004, Kim a ainsi conduit la première étude d’imagerie de fluorescence en temps réel, sur des animaux, avec comme agent de contraste des QDs émettant à 840-860 nm ^[158]. Depuis, cette équipe a réalisé plusieurs travaux sur la localisation des ganglions lymphatiques au moyen de QDs chez la souris, le rat et le cochon ^{[134, 159-166]}.

Cependant, la quantification absolue des QDs n’a jamais été réalisée in vivo dans la fenêtre spectrale 700-900 nm à cause de la diffusion des photons dans les tissus. En effet, en imagerie de fluorescence 2 dimensions, l’apparence des structures profondes est fortement estompée et le signal détecté provenant des ces structures est significativement atténué en fonction de leur profondeur ^[167]. De plus, l’atténuation des photons n’est pas linéaire en

fonction de la profondeur et l’hétérogénéité optique des tissus obscurcit la quantification du signal de fluorescence. Par exemple, une petite structure avec une forte concentration en agent de contraste, située profondément dans les tissus peut fournir le même signal de fluorescence qu’une plus grosse structure contenant une faible concentration en fluorochrome mais située à la surface des tissus (Figure 15). Ainsi, l’interprétation des données et des images requiert des logiciels de traitement avancés capables de prendre en compte la nature diffuse des photons de propagation dans les tissus ^[167]. Ainsi, l’émergence des modèles mathématiques, associée avec le développement technologique des appareils d’illumination et de détection ont amélioré la visualisation des agents de contrastes dans les tissus.

Figure 15. Nature diffuse des photons en milieu biologique et conséquence sur l’imagerie de fluorescence 2

dimensions. Des structures de taille et en concentration de produit de contraste différentes, incluses dans un milieu diffusant à différentes profondeurs, peuvent avoir la même apparence en surface, empêchant ainsi toute quantification absolue. ^[167]

Grâce aux avancées technologiques dans de nombreux domaines, de nouveaux systèmes d’imagerie de fluorescence 2 dimensions ont été créés et commercialisés tels que le « Maestro In Vivo Imaging System » (CRI Inc, Woburn, MA, USA), le « Xenogen IVIS-20 Optical In Vivo Imaging System » (Xenogen-Caliper, LS, Alameda CA, USA), ou encore le Fluobeam® (Fluoptics, Grenoble, France) utilisé dans notre Laboratoire. Tous ces instruments contiennent une caméra CDD haute résolution, hautement sensible dans le domaine spectral du PIR et sont capables de semi-quantifier des signaux de fluorescence émis par un fluorophore ^[122].

L’avantage de cette modalité est qu’elle permet l’analyse du même animal plusieurs fois pendant une longue période expérimentale, celui-ci étant son propre témoin. Avec ce système d’imagerie, le nombre d’animaux utilisé est réduit et les variations intra-individuelles sont minimisées, améliorant ainsi les données obtenues. Pour quantifier les QDs in vivo, la première étape est d’acquérir la « ligne de base » des animaux avant injection des QDs qui comprend le bruit de l’appareil ainsi que l’autofluorescence des tissus. Ce bruit de fond doit

être enregistré pour chaque animal et sera par la suite soustrait des images de fluorescence acquises après injection de l’agent de contraste. La seconde étape consiste en l’injection des QDs et l’acquisition des images aux différents temps désirés après leur administration. La dernière étape est le traitement des données enregistrées. Les intensités de fluorescence sont délimitées en sélectionnant des régions d’intérêts (ROIs) provenant des images acquises. Cette technique présente un inconvénient car elle ne fournit pas d’information sur la concentration absolue des QDs. Néanmoins, il est possible de comparer les intensités de fluorescence normalisées extraites de différentes ROIs, en fonction du temps, par exemple. L’imagerie de fluorescence permet donc l’évaluation semi-quantitative des QDs en se basant sur les changements d’intensité de fluorescence provenant des QDs dans les ROIs étudiées

[122]

. Bien que cette modalité soit attrayante, peu d’études sur la quantification des QDs in vivo ont été réalisées.

La première étude pour laquelle des QDs émettant dans le PIR ont été semi-quantifiés par imagerie de fluorescence a été rapportée par l’équipe de Morgan en 2005 ^[168]. Les auteurs ont mesuré l’intensité de fluorescence des QDs en fonction du temps sur un modèle tumoral murin de carcinome épidermoïde après injection intraveineuse (i.v.) des QDs et ont enregistré les changements dynamiques d’intensité de fluorescence des QDs dans quelques organes. Ils ont observé la captation et l’élimination des QDs par les tissus tumoraux, avec une phase d’élimination plus lente comparée à l’élimination des QDs du système sanguin, suggérant que l’échange de QDs entre la circulation sanguine et la tumeur peut être différent. De plus, ils ont fourni des données préliminaires quant à l’élimination des QDs contenus dans différents tissus tels que le cœur, les aires abdominales ou le sang.

Cai et al. ont démontré que des QDs couplés à un peptide (arginine-glycine-acide aspartique) ciblant la vascularisation tumorale reconnaissaient spécifiquement des glioblastomes humains greffés chez la souris ^[140]. Ils ont comparé la distribution intra-tumorale des QDs couplés ou non au peptide après leur injection i.v. en mesurant l’intensité de fluorescence émise par la tumeur en fonction du temps. Ils ont montré que la quantité de QDs couplés dans la tumeur était 4 fois plus importante que pour les non couplés, 6 h après administration.

L’équipe de Diagaradjane a montré que des QDs greffés avec du facteur de croissance épidermoïde (EGF) pouvaient être utilisés comme agent de contraste semi-quantifiable et

reproductible chez des souris porteuses de tumeurs colorectales surexprimant le récepteur à l’EGF ^[169]. Les auteurs ont aussi observé que 6 h après injection i.v., la tumeur accumulait 2,5 fois plus de QDs couplés comparé à ceux qui ne l’étaient pas.

Le groupe de Gao a testé l’habilité de QDs émettant à 607 nm, liés à de l’agglutinine de germe de blé, à passer la barrière hémato-encéphalique après leur administration intranasale chez la souris ^[170]. Ils ont détecté par imagerie de fluorescence des QDs dans le cerveau des souris dès 2 min après leur inhalation et ont observé un maximum de fluorescence 4 h après injection, correspondant à 13 fois le signal obtenu à 2 min.

Papagiannaros et al. ont comparé l’accumulation de 2 QDs émettant à 800 nm (commerciaux et synthétisés dans leur Laboratoire) sur un modèle tumoral murin ^[171]. L’intensité de fluorescence maximale dans la tumeur a été atteinte après 1 h pour les QDs synthétisés au sein de leur Laboratoire, contre 4 h pour les commerciaux. De plus, le signal de fluorescence émis par les QDs de l’équipe était plus important que le signal d’une demi dose de QDs commerciaux.

Des études sur la quantification des QDs ex vivo ont également été réalisées par imagerie de fluorescence sur des organes disséqués, apportant toujours des données semi-quantitatives ^{[118, 142, 169-172]}. L’imagerie de fluorescence ex vivo est toujours associée à une imagerie in vivo et confirme généralement les données obtenues in vivo, et dans certains cas, les QDs non détectés in vivo, le sont ex vivo. Cependant pour une application ex vivo, cette modalité d’imagerie perd ses principaux avantages que sont son caractère non-invasif et la possibilité de faire de l’imagerie à répétition sur les mêmes animaux, même si elle permet la visualisation directe des QDs dans les organes d’intérêt.

Très récemment, de nouveaux systèmes d’imagerie de fluorescence ont été développés. Il s’agit de tomographes de fluorescence 3 dimensions, le plus souvent couplés à un scanner à rayons X ou à IRM qui fournissent des données anatomiques. Ce système d’imagerie permet de quantifier de manière absolue la concentartion d’un fluorophore dans différents compartiments biologiques chez l’animal vivant. Plusieurs tomographes de fluorescence 3 dimensions ont été crées tels que le « FMT System » et le « FMT 2500 System », commercialisés par VisEn Medical Inc (Woburn, MA, USA) ou encore un imageur développé par le CEA-LETI (Grenoble, France) en collaboration avec la société Cyberstar

(Grenoble, France). Cependant, à l’heure actuelle, aucun article n’est paru sur la détection et/ou la quantification de QDs in vivo au moyen de ces instruments.