Imagerie calcique

Les tranches extraites d’un même cerveau sont déposées individuellement dans une chambre d’enregistrement sous le trajet optique d’un microscope à épifluorescence (BX51 Olympus) en baignant à température ambiante, et à un débit continu (2-3 ml/min) dans la solution de perfusion en présence ou non d’agents pharmacologiques selon l’expérience menée. Une fois la tranche mise sous le microscope, la région démyélinisée du corps calleux est repérée sur chaque tranche par vidéomicroscopie (DIC) en utilisant l’objectif 4X. La présence d’une région plus claire et brillante au niveau du corps calleux indique la présence d’une lésion (Figure 16-A). Son identification est confirmée par épifluorescence à l’objectif 40X (λ 470nm) car la zone démyélinisée contient une plus forte densité de cellules GCaMP3 positives qui résultent de la période de recrutement des OPCs dans la lésion (voir Résultats).

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A- B-

Figure 16 - Corps calleux de souris visualisé sur tranches aigues de cerveau coupées selon le plan coronal (objectif 4x, DIC)

A- Corps calleux avec lésion démyélinisante induite par le LPC (entourée de pointillés blancs) B- Corps calleux sans lésion

Après l’identification de la lésion, la profondeur d’enregistrement sur les tranches au niveau de la lésion du corps calleux est prise en compte. Elle ne doit pas être en surface pour éviter les cellules mortes, ni trop en profondeur pour favoriser la détection d’évènements calciques. Pendant l’enregistrement calcique (objectif 40X), la tranche de cerveau est illuminée sur toute sa surface par épifluorescence à une longueur d’onde monochromatique de 470 nm, à une fréquence de 10Hz pendant environ 3 min et avec un temps d’exposition de 50 ms grâce à un système de LED (CoolLed pE-2) commandé par le logiciel Clampex à travers l’interface Digidata 1440A (Molecular Device). Une caméra CCD (charged-coupled device, Optimos) synchronisée avec le système de LED enregistre les images sous le logiciel Micromanager (ImageJ). Le nombre d’enregistrements par tranche est de 3 maximums pour minimiser le photoblanchiment du marqueur calcique au niveau de l’enregistrement.

Les enregistrements calciques sont réalisés sur tranches issues de 2 stades de remyélinisation différents(112):

• Population 1 : Souris à 3-5 jpi (Période de recrutement et de prolifération des OPCs) • Population 2 : Souris à 13-14 jpi (Période de différenciation des OPCs en oligodendrocytes) Les cellules OPCs ont été mises en évidence morphologiquement et reconnues sur tranches aigues de cerveau par microscopie à épifluorescence grâce au marqueur calcique GCaMP3 fluorescent

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microgliales activées. La distinction OPCs-péricytes est facile sur le plan morphologique. En effet, les péricytes se trouvent associés à des vaisseaux sanguins visibles par microscopie et ont une morphologie bipolaire qui délimite le vaisseau.

4.1 Pharmacologie

Plusieurs outils pharmacologiques appliqués dans le bain ont été utilisés pour investiguer les mécanismes de signalisation qui soutiennent l’activité calcique de l’oligodendroglie dans les lésions démyélinisantes. Nous avons utilisé d’abord 0.5 µM de tétrodotoxine (TTX), un inhibiteur des canaux sodiques voltage-dépendants très nombreux au niveau des nœuds de Ranvier des neurones, et qui bloque donc l’émission de potentiel d’action. Puis, 100 µM de Cadmium (Cd2+_{) a été appliqué}

afin de bloquer les canaux calciques dépendants du potentiel de type haut seuil (L-type VGCCs). Pour inhiber les canaux calciques à bas seuil (T-type VGCCS), nous avons testé 200 µM de chlorure de Nickel (NiCl2). Finalement, un cocktail d’inhibiteurs des récepteurs métabotropiques au

glutamate, composé de 50 µM de MPEP (2-Methyl-6-(phenylethynyl)pyridine hydrochloride, un inhibiteur de GluRm5 du groupe I) et de 100 µM de CPPK ((RS)-α-Cyclopropyl-4- phosphonophenylglycine, un inhibiteur de GluRm du groupe II et III), a été également testé. Tous les inhibiteurs ont été dilués dans une solution de perfusion (extracellulaire). L’enregistrement commence après 3-5 min de l’application de la solution de TTX, tandis que pour le Nickel, Cadmium, iGluRm, il débute après 10 min d’application sur tranche.

Pour les deux stades de remyélinisation à 3-5 jpi et à 13-14 jpi, des tranches contrôles sans molécule inhibitrice ont d’abord été enregistrées, suivi d’un deuxième enregistrement en présence des inhibiteurs (TTX, NiCl2, Cd2+ ou iGluRm). De plus, des enregistrements ont été réalisés en appliquant

directement les inhibiteurs afin de distinguer si une diminution du signal observée serait liée à l’effet des inhibiteurs ou au photoblanchiment du marqueur calcique.

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4.2 Analyse des enregistrements calciques

Chaque enregistrement est composé de 1500 images prises à une fréquence de 10 Hz. Pour toutes les images de l’enregistrement, 100 ROIs (Region Of Interests) ont été définis en forme de rectangle de taille identique. Les données brutes d’intensité de fluorescence au cours du temps ont été extraites pour chacun des 100 ROI à l’aide du logiciel image J, puis traitées sous Excel. Les 20 premiers points de chaque trace ont été enlevés car elle montrait une forte décroissance pendant cette période. Le fluorochrome de la GCaMP3 perd de sa brillance lorsqu’il est soumis à une excitation lumineuse prolongée ce qui se traduit par une diminution de fluorescence au cours du temps ne correspondant pas à la perte d’un vrai signal calcique. Pour s’affranchir de ce phénomène de photoblanchiment, les 100 traces ont été ajustées avec une double exponentielle décroissante. L’ajustement a ensuite été soustrait pour tous les ROIs d’un même enregistrement sous le logiciel Igor 6.0 Pro à l’aide de l’outil Neuromatic et une macro développée par l’équipe (Voir Résultats).

Ainsi, grâce à cette analyse peuvent être détectées des augmentations de fluorescence correspondant à une augmentation calcique intracellulaire. Un ROI est défini comme « actif » (ayant des réponses calciques), si et seulement si la valeur de son aire sous la courbe (Area-Under-the-Curve : AUC) est deux fois supérieure à son écart-type. L’écart-type a été calculé par la moyenne des écarts-types de 6 AUC consécutifs de ROIs du même enregistrement ne présentant pas d’activité au cours du temps. La courbe des AUC nous a permis de choisir ces 6 ROIs pour lesquelles aucune activité n’a été détectée.

Deux paramètres ont été définis pour pouvoir comparer les enregistrements calciques. Le premier paramètre déterminé est la moyenne des pourcentages de ROIs « actifs » qui se définit par le nombre de ROIs pour lesquels une augmentation de fluorescence a été détectée sur un enregistrement divisé par le nombre total de ROIs (soit 100).

Etant donné la grande variabilité des amplitudes et des cinétiques des événements calciques détectés, nous avons opté pour déterminer un deuxième paramètre : les moyennes des aires sous la courbe des ROIs « actifs ». L’intérêt de ce paramètre est de donner une information sur l’intensité et/ou la fréquence des évènements calciques au niveau d’un enregistrement.

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4.3 Tests statistiques

Les analyses statistiques sont effectuées avec le logiciel Graphpad (Prism). Nos valeurs ne respectent pas la loi normale, la distribution des valeurs est non gaussienne. Le test de Kruskal Wallis a été utilisé pour comparer les médianes des 2 paramètres. Il s’agit d’un test non paramétrique qui est une alternative du test ANOVA lorsque l’hypothèse de normalité n’est pas acceptable. Il s’applique pour des échantillons indépendants provenant de populations différentes. Ensuite, le test de Dunn’s non paramétrique a été utilisé pour comparer plusieurs groupes supérieurs à 3 de taille différente. Pour la comparaison de données non pairées de deux groupes : contrôle et cadmium, le test de Mann Whitney non paramétrique a été utilisé. Les valeurs aberrantes au sein d’un même groupe de mesure ont été enlevées et identifiées par un test d’outlier du logiciel Graphpad (Prism).