3.2 Modélisation d’applications Web sous forme d’agents logiques
3.2.5 Illustration : agent gérant un hypertexte
Desde a introdução de cefalosporinas de terceira geração em ambiente hospitalar as bactérias Gram negativo têm reagido a estes antibióticos, principalmente com a produção de novos tipos de p-lactamases de espectro alargado, mediadas por plasmídeos (Matsumoto & Inoue, 1999).
Isolados de E. coli, produtores de p-lactamases de espectro alargado foram pela primeira vez descritos em Portugal durante um estudo de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos de isolados de doentes hospitalares e ambulatórios colhidos entre 1988 e 1990 (Sousa et ai., 1991). A caracterização molecular das enzimas que conferiam a resistência aos oximino-p-lactâmicos revelou a presença de SHV-5 (Peixe,
1996) e TEM-6b (Peixe era/., 1996).
No presente trabalho, isolados de E. coli produtores de p-lactamases de espectro alargado foram inicialmente detectados através do teste de sinergismo, e posteriormente confirmados por "E-test" (Quadro XV). O método de sinergismo demonstrou ser um método eficaz, reprodutível, e com sensibilidade para a detecção destas enzimas. Além disso verificou-se concordância entre os resultados obtidos com este teste e o método de "E-test".
Nestes isolados foi visualizado um notável sinergismo entre o disco da associação amoxicilina/ácido clavulânico, os discos de todas as cefalosporinas de terceira geração usadas (ceftazidima, cefotaxima e ceftriaxona) e o disco de aztreonamo.
alargado derivadas de TEM. É de salientar a permanência destes isolados nas diferentes praias desde Fevereiro a Julho de 2000. Contudo, os isolados foram predominantemente obtidos nos meses de Março e Maio de 2000 (Quadro XXII). O baixo número de isolados obtidos (n=1) entre estes meses poderá ser resultado da elevada pluviosidade ocorrida em Abril de 2000. O isolamento desta estirpe durante vários meses poderá reflectir o lançamento constante de águas residuais que atingem as praias em estudo.
Observou-se que todos estes isolados apresentaram um comportamento muito similar no que respeita à susceptibilidade aos antibióticos estudados.
A semelhança de comportamento face aos diversos antibióticos, perfil (3- lactamásico e plasmídico idênticos, sugeria que estes isolados seriam uma mesma estirpe, tendo por caracterização genómica de alguns destes isolados, através de ERIC-PCR (Figura III) confirmado esta hipótese.
O método ERIC-PCR é um método simples, altamente reprodutível, que permite distinguir estirpes estreitamente relacionadas, deduzir relações filogenéticas entre estirpes e, ainda, estudar a sua diversidade numa variedade de ecossistemas. Este método foi usado com sucesso, na diferenciação de algumas estirpes, como por exemplo, de Bartonella (Rodriguez-Barradas ef a/., 1995), Citrobacter diversus (Woods
et ai., 1992), Enterobacter aerogenes (Georghiou et ai., 1995), Rhizobium meliloti (De
Bruijn, 1992), Francisella tularensis (De la Puente-Redondo era/., 2000), Haemophilus
influenzae (Gomez-de-Leon ef al., 2000); Pasteurella multocida (Loubinoux et ai.,
1999), na diferenciação de estirpes de E. coli de origem animal ou humana (Dombek
et ai., 2000) e na separação de grupos filogenéticos e não patogénicos de E. coli
(Johnson & O'Brian, 2000).
Os isolados marinhos de E. coli produtores de (3-lactamases de espectro alargado derivadas de TEM apresentaram resistência às aminopenicilinas, carboxipenicilinas, cefalosporinas de primeira geração, e susceptibilidade à cefoxitina e imipenemo. Além disso, estes isolados revelaram diminuição da susceptibilidade às cefalosporinas de terceira geração (Quadro XI). Este fenótipo de resistência, está habitualmente associado a oximino-(3-lactamases plasmídicas derivadas de TEM-1, 2 ou SHV-1 (Bush et ai., 1995; Sirot,1995). Além dos isolados apresentarem resistência a antibióticos pertencentes à família dos (3-lactâmicos também revelaram resistência ao ácido nalidíxico, norfloxacina e tetraciclina.
Em Portugal, recentemente (Caniça et ai., 2000), foram estudadas trezentas e vinte e duas estirpes de E. coli provenientes de laboratórios hospitalares da zona Norte, Centro e Sul. A frequência de resistência de estirpes à amoxicilina encontrada foi de 58% (186/322), 7% à associação amoxicilina/ácido clavulânico e 17% à cefalotina. Das cento e oitenta e seis estirpes resistentes à amoxicilina, apenas 8 estirpes com teste de sinergismo positivo são resistente aos oximino-p-lactâmicos: resistência à cefotaxima (n=1), ao aztreonamo (n=3), à ceftazidima e aztreonamo (n=2), à ceftazidima e aztreonamo e ceftriaxona (n=1) e à ceftazidima e aztreonamo e ceftriaxona e cefotaxima (n=1) (Caniça et ai., 2000). Os principais mecanismos de resistência encontrados, nestas estirpes foram a hiperprodução de p-lactamases do tipo TEM-1 e a produção de enzimas do tipo OXA-1, ambas detectadas em estirpes resistentes à associação amoxicilina/ácido clavulânico (Caniça ef ai., 2000). Este trabalho não revela, contudo, o perfil p-lactamásico das estirpes com prova de sinergismo positivo.
De acordo com as CMIs obtidas para as oximinocefalosporinas, os isolados marinhos de E. coli produtores de p-lactamases de espectro alargado obtidos não são considerados resistentes à ceftazidima (CMI 8-12 u.g/ml), cefotaxima (6-8 ug/ml) e ceftriaxona (8-12 ug/ml), de acordo com NCCLS (1999) (Quadro XI). No entanto, Katsanis er ai. (1994) demostraram que as CIMs de cefotaxima e ceftriaxona, para isolados de £. coli que produzem p-lactamases de espectro alargado, frequentemente não excedem o "breakpoint" que permite considerar a bactéria como resistente. Contudo, in vivo, estes isolados poderão funcionar como resistentes, originar casos de insucessos terapêuticos.
Determinou-se o ponto isoeléctrico em isolados pertencentes ao grupo que apresentava um fenótipo de resistência similar. Todos os isolados revelaram duas bandas de p-lactamase, uma banda de pi 5,4, um ponto isoeléctrico semelhante a TEM-1, e outra banda de pi 5,9 (Quadro XI). Com ponto isoeléctrico próximo de 5,9 foram já descritas diversas enzimas, nomeadamente TEM-4 (Paul et ai., 1989), TEM-6 (Bauernfeind & Hórl, 1987), TEM-8 (Goussard & Courvalin, 1999), TEM-27 (Morosini er
ai., 1995) e TEM-52 (Pai er ai., 1999). No Norte de Portugal, foi já isolada uma estirpe
hospitalar de E. coli produtora de p-lactamase de espectro alargado com pi 5,87, que foi identificada como TEM-6b (Peixe, 1996).
A posterior sequenciação nucleótida da p-lactamase produzida por E. coli proveniente de águas marinhas permitirá identificar esta p-lactamase e eventualmente, facilitar a identificação da sua origem.
Nos isolados de E. coli em estudo, a presença concomitante de TEM-1, nestes isolados, poderá compensar a perda de actividade p-lactamásica que acompanha as P-lactamases de espectro alargado (Jacoby, 1994).
A utilização de uma sonda para o gene TEM e a sua utilização em transformantes permitiu verificar que o gene que codifica a P-lactamase de espectro alargado se encontra num plasmídeo diferente do que os que codificam a TEM-1 (Figura VII). Apesar desta enzima não ser TEM-1, o pequeno número de mutações não é suficiente para impedir a hibridação nas condições de restringência usadas.
Através de ensaios de transferência de genes verificou-se que a p-lactamase de espectro alargado de pi 5,9 estava associada a um plasmídeo conjugativo de 30 Md.
Ao contrário de resultados obtidos para estirpes de origem clínica (Peixe, 1996), a transferência dos genes que codificam a resistência aos p-lactâmicos não foi acompanhada por genes que conferem resistência a outros antibióticos.
O facto de se ter conseguido demonstrar a capacidade de transferência é relevante, uma vez que estes isolados são provenientes do meio ambiente. Convém salientar que diversos autores demonstraram já a possibilidade de transferência de genes em ambiente marinho quer através de transformação (Paul ef a/., 1991; Stewart & Sinigalliano, 1990) quer através de conjugação (Dahlberg et ai., 1998; Femandez- Astorga et ai., 1992; Gauthier & Breittmayer, 1990; Goodman ef ai., 1993). Este fenómeno não deixa de ser preocupante, não só pela possibilidade destes microrganismos ocasionarem infecções, tanto por ingestão, inalação, contacto ou mesmo consumo de alimentos marinhos, como também, pela sua capacidade de transferirem os genes codificadores destas enzimas a outros microrganismos, incluindo bactérias comensais do Homem, peixes e outros organismos marinhos e às autóctones.