Les techniques d’imagerie en champ large que nous avons développées pourraient fortement bénéficier de l’utilisation d’une illumination structurée en remplacement de l’illumination homogène. La technique de microscopie en illumination structurée a été proposée comme alternative moins onéreuse à la microscopie confocale (Neil et al. 1997). Le principe consiste à illuminer les tissus non plus de façon homogène, mais, à l’aide d’un motif, généralement d’intensité périodique sinusoïdale. Trois images sont enregistrées pour trois positions différentes du motif (phases spatiales de 0, 2p/3, 4p/3). Les images enregistrées contiennent à la fois l’information au plan focal et hors plan focal, cependant les signaux dans le plan focal
sont beaucoup plus fortement modulés que ceux hors plan focal. On peut alors, à l’aide d’algorithmes simples de démodulation obtenir une image du plan focal avec une résolution axiale beaucoup plus élevé qu’en microcopie en champ large en illumination homogène. Ce dispositif a été mis en œuvre et caractérisé pour la microscopie de fluorescence à l’échelle cellulaire sur la base de grille dont l’image est projetée sur le tissu et des cellules en cultures (Barlow & Guerin 2007; Langhorst et al. 2009). Un dispositif commercial est par ailleurs disponible (Zeiss Apotome) et adaptable sur un microscope de fluorescence classique pour la microscopie dans le régime de diffraction. Dans une étude théorique et expérimentale, Chasle et al ont montré que ce dispositif était non optimal en terme de résolution axial, du fait du choix de la fréquence spatiale de la grille utilisée. Le contraste du motif d’illumination influence fortement la sensibilité de la technique (Chasles et al. 2007).
L’utilisation de l’illumination structurée que nous proposons ici s’adresse au domaine où la résolution est limitée par la diffusion multiple. Sa mise en oeuvre pour l’étude dynamique de tissus cérébraux in vivo n’a pas encore été réalisée et constitue un développement excitant pour les trois modalités : réflectance, fluorescence, contraste speckle que nous avons développées jusqu’à présent. L’un des défauts de l’imagerie en illumination structurée est la rétention d’une partie du motif sur les images reconstruites du fait d’un déphasage imparfait entre les images. Cet artefact est d’autant plus important pour les études dynamiques où la stabilisation de la grille après déplacement par un piézo-électrique peut prendre jusqu’à quelques dizaines de millisecondes. Nous proposons de développer un dispositif utilisant un modulateur spatial à commutation rapide qui dépasse cette contrainte et présente une grande flexibilité en terme de fréquence spatiale du motif utilisé. Un tel dispositif a été développé récemment par une équipe du Beckmann Laser Institute (Irvine, Etats Unis) (Weber et al. 2006). La principale originalité du dispositif est l’utilisation d’un modulateur spatial, composé d’une matrice de micro-miroirs (« digital micro mirors » ou DMD), du même type que celui que nous utilisons dans la source spectrale à commutation rapide (cf. partie II paragraphe 3.3). Ce composant permet (i) de varier la fréquence spatiale du motif d’illumination et (ii) la commutation entre chaque position de la grille en quelques dizaines de microsecondes. Pour faire évoluer notre dispositif vers l’illumination structurée, nous devrons interfacer une matrice DMD et synchroniser sa commutation avec la prise d’image. Ce travail instrumental constituera une prolongation relativement directe des dispositifs précédents puisque les mêmes outils seront utilisés (acquisition et interface sous micromanager, Labview, synchronisation par micro-contrôleur Arduino). Nous devrions aboutir courant 2013, à un dispositif multimodal en illumination
Figure 42 : Architecture du dispositif en illumination structurée. Les éléments additionnels pour l’illumination structurée sont en pointillés orange. SLM –Modulateur Spatial DMD, L –Lentille, M Miroirs, LCTF Filtre accordable à cristaux liquides.
Les enjeux de ce dispositif pour l’imagerie de l’activation cérébral en champ large sont multiples. Premièrement, la résolution axiale du dispositif pourra être sensiblement améliorée pour la cartographie en imagerie d’autofluorescence ou en imagerie calcique. La possibilité d’adapter la fréquence spatiale du motif devrait permettre de déterminer une fréquence optimale du motif d’illumination en fonction de la profondeur des structures étudiées. La preuve de concept de ce type d’optimisation tant pour la résolution spatiale que pour la sélectivité en profondeur a été obtenue pour des inclusions fluorescentes dans des fantômes diffusants (Mazhar et al. 2010). Deuxièmement, le dispositif pourrait être utilisé en ICLS pour laquelle l’illumination structurée devrait améliorer l’aspect quantitatif. En effet, une étude récente réalisée in vitro a montré que le choix de la fréquence d’illumination pourrait permettre d’une part, d’obtenir une sélectivité en profondeur du contraste speckle, d’autre part, de limiter voire d’éliminer l’influence des variations dynamiques d’absorption sur le contraste speckle (Mazhar et al. 2011). Troisièmement, l’imagerie IOSI multispectrale séquentielle réalisée séquentiellement à plusieurs fréquences spatiales du motif d’illumination permettra d’obtenir une cartographie dynamique in vivo des propriétés optiques d’absorption et de diffusion (Saager et al. 2010; Saager et al. 2011). Ce dernier point est essentiel puisqu’il nous permettra
de quantifier in vivo l’influence du signal de diffusion sur les signaux de réflectance (cf. partie II paragraphe 3.6). Si, dès les années 40 (Hill and Keynes 1949), la modification des propriétés d’absorption et de diffusion a été observée lors du passage d’un potentiel d’action sur des neurones isolés, la contribution des modifications des propriétés de diffusion aux signaux intrinsèques de réflectance enregistrés in vivo reste débattue. Cette question a fait l’objet de débats intenses, notamment avec la publication de premières données in vivo (Rector et al 2005) et n’est toujours pas tranchée. Une des implications majeures qui découle de cette question est la validité des études quantitatives menées en IOSI multispectrale. En effet, ces études reposent l’hypothèse d’une contribution minime des variations de diffusion. Les résultats surprenants que nous avons obtenus pour les signaux hémodynamiques dans le bulbe olfactif nous ont fait reconsidérer cette question (cf. partie II paragraphe 3.6). Nous avons montré par simulation MC considérant des variations arbitraires de la diffusion que, sous certaines conditions, les variations de diffusion pouvaient modifier les profils temporels et l’amplitude des signaux hémodynamiques obtenus (données non publiées thèse de R Renaud). La détermination IOSI en illumination structurée des propriétés optiques dynamiques au cours d’une activation devrait fournir de nouvelles données sur cette question.