Seuls, des revêtements contenant le DBHB sont évalués en conditions contrôlées. Le DBHB est la molécule ayant présenté les activités biologiques les plus intéressantes et étant disponible en quantité suffisante. Avant de tester les revêtements, une optimisation de la méthode est nécessaire.
II – A – Optimisation de la méthode
La méthode d’immersion de revêtement en conditions contrôlées est réalisée en photobioréacteur. Un photobioréacteur est une enceinte dans laquelle la croissance de microorganismes est possible. Le photobioréacteur permet de contrôler plusieurs paramètres tels que la température, le pH, l’oxygénation, l’agitation ou encore l’exposition à la lumière. Les paramètres sélectionnés pour l’expérience sont présentés dans le Tableau IV-2. Ces paramètres correspondent aux paramètres de croissance classiquement utilisés pour ces microorganismes (Grasland., 2002 ; Forján et al., 2015).
Tableau IV-2 : Paramètres de culture fixés pour la croissance en photobioréacteur
Température pH Oxygénation Agitation Lumière 20 °C 7,5 50 % 150 rotation/min
250 µmol de photons.m-2.s-1
(12H : 12H)
Dans le but d’évaluer des revêtements AF, trois méthodes sont développées. Une méthode en circuit fermé, le milieu n’est pas réapprovisionné. Deux méthodes en circuit ouvert : au cours de l’expérience, le milieu est renouvelé afin d’apporter les éléments nécessaires à la croissance des microorganismes. La différence entre les deux méthodes en circuit ouvert repose sur l’apport d’une seconde microalgue afin de diversifier la population évaluée.
Rouge : fluorescence naturelle des microalgues
Vert : marquage des bactéries au Syto9®
A B
Pour ces trois méthodes, une plaque d’acier inoxydable est immergée au fond de la cuve du photobioréacteur. Sur cette plaque sont aimantés les coupons à tester. Afin de valider les méthodes étudiées, le développement du microfouling est suivi sur des coupons de verre. Pour prélever les coupons sans rompre la stérilité, ceux-ci sont attachés à un fil de nylon.
Le photobioréacteur ainsi que la plaque contenant les coupons sont schématisés sur la Figure IV-2.
Figure IV-2 : Schématisation du système d'immersion en photobioréacteur (A : Enceinte, B : plaque d'acier inoxydable sur laquelle sont fixés les coupons en verre)
Le milieu de croissance est identique pour les trois méthodes d’immersion et est constitué d’eau de mer artificielle (ASW, 30 g/L) et de peptone de caséine (1 g/L). L’ensemble est autoclavé (Chapitre II) puis le f/2 Guillard à 2 % est ajouté stérilement. La composition de ce milieu de culture a été déterminé par Claudia Zea Obando (Obando., 2015).
Avant de démarrer l’expérience, le photobioréacteur est nettoyé et autoclavé. Après stérilisation de la cuve, la plaque contenant les coupons est ajoutée. La plaque et les fils de nylon sont au préalable stérilisés à l’éthanol absolu. Néanmoins les revêtements ne sont pas stérilisés : l’autoclavage, l’éthanol ou les UV dégraderaient les revêtements. Une fois les coupons en place, la cuve est remplie avec le milieu de croissance stérile par les pompes péristaltiques de l’automate.
Au cours de l’expérience, une mesure de la densité optique à 600 nm et une mesure de la fluorescence sont réalisées quotidiennement afin de suivre la densité cellulaire des bactéries et des microalgues (Iyapparaj et al., 2014). Par ailleurs, des étalements sur MB agar (Marine Broth agar) sont également réalisés. Pour le milieu MB agar (peptone 5,0 g, extrait de levure 1,0 g, citrate de fer 0,1, chlorure de
sodium 19,45 g, chlorure de magnésium 3,24 g, sulfate de sodium 3,24 g, chlorure de calcium 1,8 g, chlorure de potassium 0,55 g, bicarbonate de sodium 0,16 g, bromure de potassium 0,08 g, chlorure de strontium 0,034 g, acide borique 0,022 g, silicate de sodium 0,004 g, fluorure de sodium 0,0024 g, nitrate d’ammonium 0,0016 g, phosphate disodique 0,0008 g) 37,4 g du MB et 15 g d’agar sont solubilisés dans un litre d’eau distillée. Les additifs proviennent de Fisher scientific.
Sur ce milieu gélosé, les trois bactéries forment des colonies différenciables. La bactérie Paracoccus sp. 4M6 forme des colonies rondes oranges, Pseudoalteromonas sp. 5M6 des colonies rondes blanches et Bacillus sp. 4J6 forme des colonies étoilées blanches (Figure IV-3). Les étalements sur MB agar (boîte de Petri, 90 mm) permettent de déterminer la répartition bactérienne au cours du temps.
Figure IV-3 : Photographie d'une boîte gélosée MB agar avec les colonies formées par Paracoccus sp. 4M6 : colonies rondes oranges, Pseudoalteromonas sp. 5M6 : colonies rondes blanches et Bacillus sp. 4J6 : colonies étoilées blanches
Afin de suivre le microfouling, les coupons prélevés sont marqués comme dans la partie I-B, à l’aide de Syto9® permettant de visualiser les bactéries tandis que les microalgues sont visibles par autofluorescence en microscopie confocale à balayage laser (MCBL). Pour chaque coupon, trois observations sont réalisées. Chaque méthode est réalisée en triplicata. Les résultats présentent les biovolumes (déterminés par le programme COMSTAT, matlab), les densités cellulaires et les répartitions bactériennes. Un test statistique est réalisé afin de valider la significativité des résultats (ANOVA, p < 0,01).
II – A – 1 – Méthode en circuit fermé : suivi du développement de trois bactéries, une microalgue
L’adhésion, la croissance et la formation de biofilm de quatre microorganismes sont suivies. Trois bactéries marines sont inoculées : Pseudoalteromonas sp. 5M6, Paracoccus sp. 4M6 et Bacillus sp. 4J6 ainsi que la diatomée C. closterium. Le photobioréacteur contient trois litres de milieu.
Quatre jours avant le début de l’expérience, des pré-cultures des trois bactéries sont préparées dans 10 mL de milieu Zobell (Chapitre II). Les pré-cultures sont incubées à 20 °C pendant 48 heures. Après incubation de la pré-culture, des cultures de 300 mL sont réalisées en milieu Zobell et incubées à 20 °C pendant 48 heures.
4M6
4J6 5M6
Deux jours avant le début de l’expérience, une culture de 14 jours de C. closterium est axénisée (chapitre III). La culture de microalgues est placée dans une armoire phytotronique thermostatée à 20 °C, et sous éclairage pendant douze heures à 250 µmol de photons.m-2.s-1 suivies de douze heures d’obscurité. La diatomée est ensuite inoculée à 103 cellules/mL en photobioréacteur. Deux jours après, les trois bactéries sont inoculées à une densité cellulaire totale de 106 UFC/mL et ceci correspond au début de l’expérience. Pour cette méthode, le suivi du microfouling est réalisé pendant 14 jours. Un prélèvement est réalisé tous les deux jours.
Afin de prolonger le temps d’expérience, deux méthodes avec renouvellement de milieu sont évaluées.
II – A – 2 – Méthode en circuit ouvert : suivi du développement de trois bactéries, une microalgue
Les mêmes microorganismes sont utilisés : trois bactéries marines (Pseudoalteromonas sp. 5M6, Paracoccus sp. 4M6 et Bacillus sp. 4J6) et une diatomée (C. closterium). La préparation est identique à la partie II-A-1, seul le volume de milieu dans la cuve est modifié. Il est de quatre litres afin de faciliter le renouvellement du milieu.
Une fois les bactéries inoculées, la pompe péristaltique de l’automate est activée à 0,5 mL/min. Cette pompe permet à la fois d’ajouter le milieu enrichi stérile et de prélever le milieu avec les microorganismes tout en conservant un volume total constant de quatre litres dans la cuve du photobioréacteur. Le suivi du microfouling est réalisé pendant 21 jours, les coupons sont prélevés aux jours 2, 7, 9, 14, 17 et 21.
II – A – 3 – Méthode en circuit ouvert : suivi du développement de trois bactéries, deux microalgues
Pour la troisième méthode évaluée, la mise en place est identique à la méthode présentée en partie II-A-2. La différence porte sur l’incorporation d’une microalgue supplémentaire : Porphyridium purpureum, sélectionnée en raison de sa capacité à adhérer aux surfaces (Raposo et al., 2013). De plus cette microalgue est différente morphologiquement de C. closterium. Elle est ronde et dix fois plus petite. Le chapitre III a également montré que P. purpureum est moins sensible au DBHB que C. closterium.
Les conditions de renouvellement du milieu sont identiques à précédemment (0,5 mL/min). Le suivi du microfouling et de la densité cellulaire à l’état planctonique est réalisé pendant 21 jours. Les coupons sont prélevés aux jours 2, 7, 9, 14, 17 et 21.
En plus de la répartition bactérienne, réalisée par des dénombrements sur milieu MB agar, une répartition microalgale est réalisée pendant les 21 jours. Des dénombrements en cellule de Malassez permettent de différencier les cellules de C. closterium et de P. purpureum. Les paramètres variables des trois méthodes sont résumés dans le Tableau IV-3.
Tableau IV-3 : Paramètres variables sur les trois méthodes évaluées : renouvellement, temps et microorganismes inoculés
Temps Bactéries Microalgues Circuit fermé 14 jours Paracoccus sp. 4M6 Pseudoalteromonas sp. 5M6 Bacillus sp. 4J6 Cylindrotheca closterium Circuit ouvert 1 21 jours Paracoccus sp. 4M6 Pseudoalteromonas sp. 5M6 Bacillus sp. 4J6 Cylindrotheca closterium Circuit ouvert 2 21 jours Paracoccus sp. 4M6 Pseudoalteromonas sp. 5M6 Bacillus sp. 4J6 Cylindrotheca closterium Porphyridium purpureum II – B – Évaluation du DBHB
Les revêtements formulés avec le DBHB sont évalués pour les trois méthodes développées. Seuls les résultats obtenus pour la méthode en circuit ouvert 1 (avec renouvellement de milieu, trois bactéries et une microalgue) sont présentés dans la partie résultat. Les biovolumes formés sur les vernis avec DBHB sont comparés aux biovolumes obtenus sur un vernis sans DBHB servant de témoin. Un test statistique est réalisé afin de valider la significativité des inhibitions (ANOVA, p < 0,01).
II – C – Étude de la toxicité des revêtements contenant le DBHB
La toxicité des revêtements contenant le DBHB est évaluée sur trois bactéries marines (Paracoccus sp. 4M6, Pseudoalteromonas sp. 5M6 et Bacillus sp. 4J6) et sur deux microalgues (Cylindrotheca closterium et Porphyridium purpureum).
Pour se faire des milieux gélosés à 1,5 % en agar sont préparés (Zobell pour les bactéries et ASW additionné de f/2 Guillard à 2 % pour les microalgues). La préparation de ces milieux est présentée dans les chapitres II et III. Les bactéries et microalgues sont ajoutées à la gélose à 106 UFC/mL ou 105
cellules/mL, les géloses sont coulées dans des boîtes de Petri de diamètre 90 mm. Une fois sèche, une seconde couche de gélose sans microorganisme est coulée. Lorsque la seconde couche est sèche, des disques (diamètre de 2 cm) de revêtement sont déposés sur la géloses.
Pour les trois bactéries marines, les boîtes de Petri sont incubées à 20 °C pendant 48 heures. Pour les microalgues, les boites de Petri sont placées dans l’armoire phytotronique (20°C, cycle d’exposition à la lumière 12H : 12H) pendant 5 jours. Afin de quantifier le pourcentage d’inhibition induit par la présence de DBHB au sein du revêtement, les halos d’inhibition sont mesurés et comparés au revêtement sans DBHB. Six boîtes de Petri sont réalisées pour chaque microorganisme.