Suite aux études macroscopique et microscopique, l’identification a été réalisée par la galerie miniaturisée API 20 E (Bio-Mérieux, France), et confirmée par la spectrométrie de masse
MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation - time of flight - mass spectrometry). (Microflex, Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
2.1 - Système API 20E (bioMérieux, France) :
2.1.1 – Principe de la technique :
Le système API 20E est un système standardisé pour l'identification des Enterobacteriaceae et autres bacilles à Gram négatif non fastidieux. La galerie compote 20 microtubes contenant des substrats sous forme déshydratée. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture et l’identification est obtenue à l’aide du tableau ou d'un logiciel d'identification (BioMérieux API 20E manual. 2010).
2.1.2 – Méthode de réalisation (BioMérieux API 20E manual. 2010) : 2.1.2.1 - Préparation de l'inoculum :
- Utiliser un tube contenant 5 ml d'eau physiologique stérile ou d'eau distillée stérile, sans additif.
- A l'aide d'une pipette, prélever une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé. Utiliser préférentiellement des cultures jeunes (18-24 heures).
- Réaliser une suspension bactérienne en homogénéisant soigneusement les bactéries dans le milieu. Cette suspension doit être utilisée extemporanément.
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2.1.2.2 - Inoculation de la galerie :
- Introduire la suspension bactérienne dans les microtubes de la galerie à l'aide de la même pipette :
Pour les tests CIT, VP et GEL, remplir tube et cupule.
Pour les autres tests, remplir uniquement les tubes (et non les cupules).
- Pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE créer une anaérobiose en remplissant leur cupule d'huile de paraffine.
- Refermer la boîte et incuber à 36°C ± 2°C pendant 18-24 heures.
- Après 24 heures, ajouter 1 goutte de réactif TDA dans la cupule du test TDA, ajouter 1 goutte de réactif JAMES sur le test IND et ajouter 1 goutte des réactifs VP 1 et VP 2 sur le test VP (attendre au minimum 10 minutes).
2.1.3 -Lecture et interprétation des résultats (BioMérieux API 20E manual. 2010) :
Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau de Lecture (Tableau 02). L’interprétation est faite à l’aide d’une feuille de calcul en format Excel.
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Tableau 02 : Tableau de lecture de l’API 20E (BioMérieux API 20E manual. 2010).
Tests Substrat Caractère recherché Résultats
Négatif Positif
ONP G
Ortho-nitro-phenyl- galactoside
Beta-galactosidase Incolore Jaune
ADH Arginine Arginine dihydrolase Jaune Rouge/orange
LDC Lysine Lysine décarboxylase Jaune Orangé
ODC Ornithine Ornithine décarboxylase Jaune Rouge/orange
CIT Citrate de sodium Utilisation du citrate Vert pâle/jaune
Bleu-vert/vert H2S Thiosulfate de sodium Production d’H2S Incolore/gris
âtre
Dépôt noir/ fin liseré
URE Urée Uréase Jaune Rouge/orangé
TDA Tryptophane Tryptophane désaminase TDA / Immédiat
Jaune Marron foncé IND Tryptophane Production d’indole IND / 2 min, maxi
Jaune Anneau rouge VP Pyruvate de sodium Production d’acétoine VP 1 + VP 2 / 10 min
incolore Rosé-rouge
GEL Gélatine de Kohn Gélatinase Non
diffusion
Diffusion du pigment noir
GLU Glucose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
MAN Mannitol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
INO Inositol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
SOR Sorbitol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
RHA Rhamnose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
SAC Saccharose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
MEL Melibiose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
AMY Amygdaline Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune
ARA Arabinose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-
vert
Jaune Ox Sur papier filter Cytochrome-oxydase Ox / 5-10 min
Incolore Anneau violet
Min : minute ; maxi : maximum.
2.2 - Spectrométrie de masse MALDI-TOF (Microflex LT) : 2.2.1 – Principe :
Le spectromètre de masse MALDI-TOF est un spectromètre où l’échantillon est mélangé à la matrice et placé sur une lame, le dépôt ainsi formé est appelé cible. Une source laser est dirigée sur la cible afin d’ioniser les molécules de l’échantillon (MALDI = Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionisation). Les ions sont ensuite détectés en mesurant le temps que mettent
les différentes particules à atteindre le détecteur (TOF = Time-Of-Flight). Une fois l’ion arrivé au détecteur, le signal est amplifié et envoyé à un ordinateur qui traite les données et donne les résultats sous forme de spectre. Un spectre à un score d’identification >1.9 est considéré fiable et correcte.
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2.2.2 – Méthode de réalisation (MALDI-TOF MS manual, URMITE 2013) : 2.2.2.1 - Nettoyage de la cible (plaque en stainless steel avec 96 puits) :
Manipulation à réaliser sous hotte chimique avec des gants :
- Rincer la cible sous l’eau chaude du robinet en frottant avec du papier de précision
(type Kim Wipes) afin de ne pas la rayer, puis rincer avec de l’éthanol à 70% en frottant avec du papier de précision.
- Répéter la première étape.
- Placer la cible dans un petit réservoir en inox ou céramique et la recouvrir d’éthanol
70%.
- Laisser agir pendant 15 minutes puis éliminer l’éthanol dans une poubelle appropriée. - Déposer sur la cible 500 μl de TFA 80 %, frotter avec du papier de précision.
- Rincer la cible avec de l’eau HPLC et laisser sécher pendant 15 minutes. 2.2.2.2 - Préparation de la matrice :
La matrice permet de minimiser la dégradation de l'échantillon provoquée par l'absorption de l'énergie des faisceaux laser incidents. La préparation est à réaliser sous hotte chimique avec des gants lors de la manipulation des produits chimiques. La matrice doit être préparée avant chaque série d’analyse selon le protocole suivant :
- Dans un tube polypropyléne de 1.5 ml, introduire 2 pointes de spatules d’alpha-cyano-
4- hydroxy-cinnamic acid (HCCA).
- Ajouter 500 μl d’acétonitrile HPLC. - Ajouter 25 μl de TFA à 10%. - Ajouter 475 μl d’eau HPLC.
- Vortexer ou secouer vigoureusement.
- Soniquer pendant 10 minutes dans un bain à ultrasons, puis centrifuger 5 min à 13000
rpm.
- Transférer le surnageant dans un tube polypropylène propre.
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2.2.2.3 - Dépôt des échantillons sur la cible Maldi :
Manipulations sous PSM avec des gants :
- Compléter le plan de dépôt de la cible MALDI utilisée en indiquant la référence des
échantillons déposés.
- Déposer 2 spots de 1.5 μl du témoin positif (T+) (fournie par le responsable de
spectrométrie de masse) et recouvrir chaque dépôt de 1.5 μl de matrice saturée.
- Sur la ligne suivante même colonne, déposer 2 spots du témoin négatif (1.5 μl de
matrice).
- Sur les lignes suivantes, déposer chaque échantillon en fine couche homogène en 4
exemplaires sur la cible : en prélevant une petite quantité de colonies bactériennes fraiches différentes pour un même échantillon à l’aide d’une pointe de cône de pipette de 10 μl.
- Déposer 1.5 μl de matrice sur chaque spot, une fois tous les dépôts effectués.
- Laisser sécher pendant 5 min sous PSM pour permettre sa co-cristallisation avec
l'échantillon bactérien, puis ranger la cible MALDI dans sa boite plastique.
2.2.2.4 - Insertion de la cible et lancement du MALDI-TOF :
- Introduire la cible dans l’appareillage (Microflex, Bruker Daltonics, Bremen, Germany), elle est alors exposée sous- vide, aux tris du laser.
- Remplir la fiche du logiciel MALDI Biotyper Automation Control. - Lancer le spectromètre de masse : Microflex.
2.2.3 - Interprétation des résultats de l’analyse spectrométrique :
Le MALDI –TOF identifie les microorganismes en utilisant le logiciel Biotyper 2.0. La spectrométrie de masse permet de mesurer une unique empreinte moléculaire d’un organisme, plus précisément, le logiciel Biotyper MALDI mesure les protéines très abondantes qui se trouvent dans tous les micro-organismes. Les motifs caractéristiques de ces protéines très abondantes sont utilisés pour identifier d’une manière fiable et précise un micro-organisme particulier, en faisant correspondre le modèle respectif à une base de données étendue, ouverte, pour déterminer l’identité du micro-organisme jusqu’au niveau d’espèce.
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3. Tests de sensibilité aux antibiotiques : 3.1 – Principe de la technique :
Les tests de sensibilité aux antibiotiques ont été exécutés par la méthode de diffusion de disque sur gélose Mueller Hinton (Becton, Dickinson and Company, France), selon les recommandations de la CA-SFM 2013, et avec une série de 16 antibiotiques : (amoxicilline/acide clavulanique, amoxicilline, céftriaxone, céfotaxime, céfpirome, céftazidime, aztréonam, imipénème, amikacine, tobramycine, gentamicine, ciprofloxacine, ofloxacine, trimethoprime/sulfaméthoxazole, nitrofurans, colistine).Tableau 03.
3.2 – Méthode de réalisation (CA-SFM. 2013) :
- A partir d’une culture de 18 à 24 heures sur milieu gélosé non sélectif, préparer un inoculum bactérien en solution saline (0,9 % NaCl) équivalent au standard 0,5 McFarland (~ 108 UFC/ml).
- Ensemencer par écouvillonnage les boites de gélose Mueller Hinton.
- Déposer les disques d’antibiotiques sur la surface des géloses, à l’aide d’un distributeur automatique.
- Incuber pendant 18 à 24 heures à 37°C.
3.3 – Interprétation des résultats :
Après 18 à 24 heures d’incubation à 35-37° C, et à l’aide d’un pied à coulisse, les différents diamètres des zones d’inhibition obtenus autour des disques d’antibiotiques ont été mesurés. L’interprétation en Sensible (S), Intermédiaire (I) ou Résistante (R) a été effectuée selon les critères définis par la CA-SFM (CA-SFM, 2013).
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µg : microgramme ; S : sensible ; R : résistante.
Familles Antibiotiques Abréviations Charge du
disque
Diamètres critiques S R
Céphalosporine 3eme génération Céftriaxone CRO 30µg ≥26 ‹23
Céphalosporine 3eme génération Céfotaxime CTX 30µg ≥26 ‹23
Céphalosporine 3eme génération Céftazidime CAZ 30µg ≥26 ‹21
Céphalosporine 4eme génération Céfépime FEP 30µg ≥24 ‹21
Aminopénicillines +inhibiteur B- lactamase
Amoxicilline-acide – clavulanique
AMC 20µg/10µg ≥21 ‹16
Monobactames Aztréonam ATM 5µg ≥27 ‹21
Carbapénèmes Imipénème IMP 10µg ≥24 ‹17
Aminosides Tobramycine TOB 30µg ≥18 ‹16 Amikacine AK 10µg ≥17 ‹15 Gentamicine GN 10µg ≥18 ‹16 Quinolones Ofloxacine OFX 5µg ≥25 ‹22 Ciprofloxacine CIP 5µg ≥25 ‹22 Sulfamides Triméthoprime Sulfaméthoxazole SXT 1,25µg/23,75µg ≥16 ‹13 Polymyxines Colistine CS 50µg ≥15 ‹15
Nitrofuranes Nitrofurantoïne NIT 300µg ≥15 ‹15
b êta -lact am in es
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La CMI correspond à la plus petite concentration en antibiotique qui inhibe la croissance bactérienne, sa détermination peut être effectuée par dilution en milieu gélosé ou par dilution en milieu liquide. Les CMIs des principales familles d’antibiotiques (bêta-lactamines, quinolones et aminoglycosides) chez les souches d’Enterobacter spp productrices de BLSE, ont été réalisées par l’utilisation des bandelettes E-test selon les recommandations de la CA- SFM.
4.1 - Principe de la technique :
La détermination de la CMI par E-test est une technique quantitative de diffusion en milieu gélosé pour la détermination de la sensibilité aux antibiotiques permettant de donner une mesure précise de sa concentration minimale inhibitrice.
L’E-test est une fine bandelette en plastique inerte et non poreuse imprégnée sur sa face inférieure par un gradient exponentiel et prédéfini d'antibiotique séché et immobilisé. Dès que la bandelette est appliquée à la surface de la gélose, il se produit un transfert immédiat de l'antibiotique sur la gélose, le gradient continu et exponentiel d'antibiotique est alors crée directement le long de la bandelette. Ce gradient couvre une plage de concentrations continue de 0,002 à 32 µg/ml, de 0,016 à 256 µg/ml ou de 0,064 à 1024 µg/ml selon les antibiotiques. Cette plage correspond à 15 dilutions doubles dans une détermination de CMI traditionnelle (http://www.microbes-edu.org/professionel/GBEA/MO006.htm).
4.2 – Méthode de réalisation :
Sous PSM :
- Préparer un inoculum bactérien en solution saline (0,9 % NaCl) équivalent au standard 0,5 McFarland (~108 UFC/ml) à partir d’une culture de 18 à 24 heures. - Ensemencer par écouvillonnage les boites de gélose Mueller Hinton.
- Sortir le paquet de bandes à utiliser du congélateur (-20°C) et le laisser revenir à la température ambiante.
- Retirer les bandes avec une pince par la partie supérieure et les déposer à la surface de la gélose ensemencée.
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Après incubation on observe une zone d'inhibition en forme d'ellipse répartie symétriquement de chaque côté de la bandelette, le point d'intersection entre la bandelette et l'extrémité inférieure de la zone d'inhibition indique la CMI de la souche. On peut l'exprimer directement en microgrammes par millilitre en se référant à l'échelle graduée inscrite sur la bandelette.
5 - Identification phénotypique de BLSE :