Identification de souches d’actinomycètes à l’aide de l’ADNr 16S

La séquence qui code pour l’ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) est utilisée comme marqueur phylogénétique en raison de sa structure, très conservée dans toutes les bactéries. Il est constitué d’une succession de domaines conservés qui constituent des sites de complémentarité pour les amorces universelles, et d’autres portions de séquences propres à un groupe de bactéries, nommées séquences signatures.

Nous avons dans un premier temps extrait l’ADN génomique, en utilisant différentes méthodes (utilisant des enzymes lytiques ou un broyage dans l’azote liquide), puis amplifié l’ADNr 16S par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Nous avons utilisé pour la PCR trois paires d’amorces différentes : une paire d’amorces universelles des bactéries qui amplifie une région d’environ 1500 pb (27F et 1492R) (Rheims et al., 1996), et deux paires d’amorces spécifiques des Actinobacteria, permettant d’amplifier respectivement des régions d’environ 600 et 300 pb : {Com2xf et Ac1186} et {ACT235 et ACT878) (Farris et Olson, 2007 ;

Schäfer et al., 2010).Le positionnement des amorces sur le gène de l’ARNr 16S est

représenté sur la Figure 29.

27F 1 220 874 1488 643 pb 281 pb 1488 pb ACT878 Ac1186 1492R Com2xf ACT235

Figure 29 : Positionnement des amorces utilisées sur le gène de l’ARNr 16S (chez

Streptomyces coelicolor A3(2)).

Les amplifications ont été contrôlées par migration électrophorétique sur gel d’agarose. Un exemple représentatif est montré sur la figure 30.

Résultats

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109 30.

Figure 30 : Résultats de la PCR après visualisation du profil de migration.

Le contenu de chaque puits est décrit dans le tableau 27 suivant.

Tableau 27 : Nature des échantillons déposés sur gel d’agarose (produits PCR des souches

474, 493 et 523). Puits Souche 1 Marqueur 2 27F et 1492R 3 Com2xf et Ac1186 4 ACT235 et ACT878 5 27F et 1492R 6 Com2xf et Ac1186 7 ACT235 et ACT878 8 27F et 1492R 9 Com2xf et Ac1186 10 ACT235 et ACT878 11 27F et 1492R 12 Com2xf et Ac1186 13 ACT235 et ACT878

Amorces utilisées Type d'extraction

474

Extraction par lyse enzymatique 523

493

Extraction par broyage dans l'azote

liquide 523

Les produits PCR montrent bien l’amplification d’un segment d’ADN de la taille attendue. Ces produits PCR ont été purifiés puis séquençés.

Résultats

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110

III.4.1. Interprétation des séquences d’ADN

Nous avons utilisés différents programmes d’analyses de séquences disponibles en ligne.

a)

Nous avons obtenu à l’aide de plusieurs amorces ciblant le même gène, plusieurs régions différentes. Le but est de reconstituer la plus grosse séquence possible, avec des chevauchements des séquences de manière à limiter au maximum les erreurs de séquençage. Voici par exemple les séquences obtenues pour la souche 469 :

En Vert : le numéro de souche

En Bleu : le nom de l’amorce

En violet : le sens de lecteur du fragment

F = Forward (direct) R = Reverse (inverse)

> 469-2F_Com2xfF TATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTTACCAAGGCTTGACATCGCCCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGGTGACAGGTGGT GCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTG ATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCACTACGG > 469-3F_ACT235F GACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC ACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGAC GGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGA GCTCGTAGGCGGTCTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGACTAGAGTGTGGTAGGGGAGA TCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGC GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGC CGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCTGGGAA

A l’aide de JaMBW, on renverse les séquences des Reverses puis on prend la séquence complémentaire pour les mettre dans le même sens de lecture que les autres.

> 469-3R_ACT878R ACGTGGATGTCGCCACACCTAGTTCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTC AGTAATGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCACA CTCTAGTCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACATCCGACGTGACAGACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATA ATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCC CTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGC CTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCTTCTACCTCAC CAACAAGCTAAAGG

> 469-3R_ACT878R- (Séquence renversée avec JaMBW)

CCTTTAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGT TGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTA GGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTG CATTCGATACGGGCAGACTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGC GAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGG TGGGAACTAGGTGTGGCGACATCCACGT > 469-2R_Ac1186R ATGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCT GTCACCCGACCACAAGGGGGGCACCATCTCTGATGCTTTCCGGGCGATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACAT GCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTATTGAGTTTAAAC

> 469-2R_Ac1186R- (Séquence renversée avec JaMBW)

b) CrustalW2

Le logiciel CrustalW2 va maintenant analyser toutes les séquences précédentes sauf les séquences R qui n’ont pas été remises dans le bon sens. Le logiciel superpose les régions

Résultats

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identiques, ce qui permet de reconstituer une plus grande partie du gène. Voici la séquence finale obtenue : > 469 CCTTTAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCG ACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC ACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCT CTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCA GCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGG CGGTCTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGAC TAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAA CACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGA ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTGGCGACATCCACGT CGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCTGGGAA

La partie bleue est issue de 469-3R_ACT878R (renversé) et la partie en vert est issue de 469- 3F_ACT235F.

c) Blast

Blast compare la séquence finale à tous les génomes recensés à ce jour et donne le degré de similitude avec les espèces les plus semblables. Dans ce cas, on peut dire que la souche 469 a beaucoup de probabilité d’appartenir au genre Streptomyces. Les degrés de similitude avec plusieurs espèces de Streptomyces ne nous permettent pas de savoir à quelle espèce appartient précisément cette souche.

Résultats

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La démarche est répétée pour les autres souches et les résultats sont écrits dans le tableau suivant :

Figure 32 : Tableau des résultats de l’identification des souches 469, 471, 474, 480, 493

et 510.

La technique d’identification par l’ADNr 16S a donc permis de savoir que toutes les souches étudiées sont des Streptomyces mais les % d’identité de séquence ne nous ont pas permis d’identifier les espèces.

La présence d’Actinomadura et de Nocardia dans les isolats est en étroite corrélation avec la technique utilisée (Larpent et Larpent-Gourgaud, 1997). Quant à l’absence des autres genres des isolats obtenus peut être expliquée soit par l'absence de ses genres dans les écosystèmes étudiés ou à cause des techniques d'isolement utilisées. Il a été rapporté que seulement 0,001-15 % de la population microbienne présente dans les échantillons environnementaux est cultivable (Amann et al., 1995). Généralement, les spores des actinomycètes sont facilement cultivables à partir des échantillons environnementaux, cependant, la sélectivité due aux milieux de culture utilisés pour l'isolement peut affecter leur croissance (Goodfellow et Simpson, 1987). La caractérisation d’un organisme en terme de phylotype ne nécessite qu’une séquence génétique et non une cellule fonctionnelle. Par conséquent, les gènes ou fragments de gènes codant pour l’ARNr 16S peuvent être sélectivement amplifiés par PCR à partir de mélanges complexes d’ADN obtenus directement

Résultats

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d’échantillons environnementaux. Cette méthode permet alors de s'affranchir de l’étape de culture des microorganismes dans un but d’identification de ces derniers (Kitouni, 2007).