Identification de résidus clefs importants pour la spécificité du domaine SH2 de NCK

Afin d’identifier facilement des résidus différents entre les domaines SH2 de NCK1 et de NCK2 pouvant contribuer à leur spécificité, j’ai réalisé des alignements multiples de chacun de ces domaines. J’ai ainsi identifié 17 résidus différentiellement conservés entre NCK1 et NCK2 (Fig. 3.11). Afin d’obtenir un aperçu de l’importance potentielle de chacun de ces résidus, j’ai superposé à cet alignement les informations connues relatives à la structure secondaire de ces deux domaines (Li and She, 2000; Frese et al., 2006), ainsi que les résidus mentionnés en introduction (section 1.4.1) et suggérés comme importants dans la spécificité générale des domaines SH2 (Waksman, 1992; Songyang et al., 1995; Tanaka, Gupta and Mayer, 1995; Huang et al., 2008).

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Figure 3. 11 : 17 acides aminés varient entre les domaines SH2 de NCK1 et NCK2.

Les séquences primaires en acides aminés de différents domaines SH2 de NCK1, NCK2 et Dock ont été alignées. La structure secondaire des domaines a été indiquée au-dessus des alignements (flèche : feuillet β ; rectangle : hélice α). Les 17 acides aminés variant entre NCK1 et NCK2 ainsi que leurs charges respectives ont été indiqués en bleu pour NCK1 et orange pour NCK2. L’arginine conservée en position βB5 essentielle pour la liaison à la tyrosine phosphorylée a été indiquée par une double flèche verte. Les acides aminés démontrés comme importants dans la spécificité des domaines SH2 ont été indiqués en rouge. Les différentes stratégies de mutation

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utilisées ont été indiquées par un code couleur (Cf. Fig. 3.13). La boucle BG, normalement composée d’une dizaine d’acides aminés dans la plupart des domaines SH2 (pointillés rouges), mais remplacée par les brins bêta βF’ et βF’’ dans les domaines de NCK2 a été indiquée (Ran and Song, 2005; Frese et al., 2006).

Ainsi, j’ai pu mettre en évidence que l’ensemble des résidus suggérés comme importants dans la spécificité des domaines SH2 tels ceux en position β3/5 ou ceux constituant les boucles EF et BG sont identiques entre NCK1 et NCK2.

J’ai ensuite utilisé les modélisations disponibles afin de visualiser la position de chacun de ces résidus au sein des domaines SH2 de NCK1/2. J’ai ainsi pu mettre en évidence que la majorité de ces résidus sont situés sur la face à l’opposé de l’interface de liaison au peptide. Uniquement 4 résidus (NCK1 : K335, K345, Q324 et Q366 ; NCK2 : V338, R348, S327 et H369) semblent situés sur la même face que l’interface de liaison au peptide (Fig. 3.12). L’ensemble de ces analyses in silico ne m’a pas permis d’identifier de motifs évidents qui pourraient être responsables de la spécificité des domaines SH2 de NCK1 et NCK2. Toutefois, la nature potentiellement atypique de l’interaction NCK2-PKP4 maintien ouverte l’hypothèse qu’un mécanisme de liaison diffèrent impliquant des résidus ou même des régions inattendues puisse expliquer cette interaction.

Afin d’élaguer le nombre de possibilités et obtenir un meilleur aperçu du ou des résidus importants pour la spécificité de ces domaines, j’ai évalué la capacité de Dock, l’unique orthologue de NCK1/2 à lier PKP4. Des essais de co-immunoprécipitation entre 3xFLAG-Dock et PKP4 endogène ont révélé que telle NCK2, Dock est aussi capable de lier PKP4 lors d’un traitement PV (Fig. 3.13a). J’ai donc inclus la séquence primaire de Dock comme paramètre dans les alignements multiples et identifié des groupes de résidus communs entre NCK2-Dock mais différents de NCK1. Sur la base des similarités et différences entre NCK1, NCK2 et/ou Dock, j’ai envisagé 4 stratégies ou séries d’acides aminés importants pouvant intervenir dans la spécificité des domaines SH2 de NCK1/2 (Fig. 3.11, 3.13b).

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Figure 3. 12 : Les acides aminés différents entre les domaines SH2 de NCK1/2 ne sont pas situés proche de l’interface de liaison au peptide.

Les domaines SH2 de NCK1 et NCK2 ont été visualisés à l’aide des données disponibles dans la littérature (PDB NCK1 : 2CI9, PDB NCK2 : 2CIA) et du logiciel Pymol. Chacun des 17 acides aminés NCK1 spécifiques (bleu) ou NCK2 spécifiques (jaune) est indiqué sur la face

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avant ou arrière du domaine. L’interface de liaison au domaine a été colorée en orange tandis que la poche de liaison acceptant la tyrosine phosphorylée a été indiquée en rouge.

Figure 3. 13 : Une inversion des domaines SH2 entre NCK1/2 n’est pas suffisante pour commuter la spécificité de ces protéines envers PKP4.

a) Identification de PKP4 comme partenaire de Dock. Des cellules HEK293T ont été transféctées avec chacune des constructions 3xFLAG indiquées puis traitées au PV avant lyse. Chaque construction 3xFLAG a été immunoprécipitée et les interactions entre ces dernières et protéines d’intérêts endogènes telle BCAR1 utilisée comme contrôle SH2 ont été visualisées à l’aide d’anticorps spécifiques (n=3). b) Illustration des 4 stratégies de mutation envisagées. Selon les alignements présentés en figure 3.11, 4 stratégies de mutation ont été envisagées. Le

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principe ainsi que les résidus mutés sont indiqués pour chacune de ces stratégies. c) Chaque mutant NCK1 demeure incapable de lier PKP4 endogène. Des cellules HEK293T ont été transféctées avec chacune des constructions 3xFLAG indiquées puis traitées au PV avant lyse. Chaque construction 3xFLAG a été immunoprécipitée et les interactions entre ces dernières et PKP4 endogène ont été visualisées à l’aide d’anticorps spécifiques (n=2). d) Les propriétés intrinsèques des domaines SH2 de NCK1/2 n’expliquent pas leurs spécificités. NCK1 et NCK2 aux domaines SH2 inversés ont été exprimées en cellules HEK293T traitées au PV puis immunoprécipités. L’association de PKP4 endogène avec chaque construction a été visualisée à l’aide d’un anticorps spécifique (n=2).

Les différentes stratégies sont les suivantes. Premièrement, en analysant les résidus NCK2-Dock communs, mais différents de NCK1, j’ai identifié 3 acides aminés identiques entre NCK2 et Dock mais différents de NCK1 (H350, D353, R377). Deuxièmement, NCK1 arbore différentiellement certains acides aminés chargés ou non comparé au duo NCK2-Dock (K286, K335, S347, H375). Troisièmement, j’ai décidé de muter les 2 acides aminés les plus proches de la poche de liaison (H301, N315), mais différents entre NCK1/2. Finalement, j’ai inversé entre NCK1/2 une série de 3 acides aminés avec une charge similaire, mais différents (H301, E336, K345) (Fig 3.13b).

Ainsi, j’ai cloné 4 NCK1 et 4 NCK2 mutants (notés m1, m2, m3, m4) aux domaines SH2 partiellement inversés que j’ai exprimé en cellules HEK293T traitées au PV. Après avoir visualisé par immunobuvardage la capacité d’interaction de chacun de ces mutants avec PKP4 endogène, j’ai constaté qu’aucun des mutants 3xFLAG-NCK1 ne gagne la capacité de lier PKP4 endogène d’une manière similaire à NCK2 (Fig. 3.13c). De plus, une expérience préliminaire suggère que tous les mutants 3xFLAG-NCK2 conservent leurs capacités à lier PKP4 endogène. À l’appui de ces résultats, j’ai voulu vérifier si l’inversion complète des domaines SH2 entre NCK1 et NCK2 serait suffisante pour commuter la spécificité de ces protéines ou si d’autres régions ou domaines pourraient être impliqués dans le contrôle de la spécificité des domaines SH2. Ainsi, j’ai créé deux NCK chimériques pleine longueur aux domaines SH2 inversés (respectivement nommés NCK1-SH2K2 et NCK2-SH2K1) puis testé la capacité de ces constructions à lier PKP4 endogène. Via la réalisation d’expériences d’immunoprécipitation et d’immunobuvardages contre PKP4 endogène, mes résultats préliminaires suggèrent que NCK1 avec le SH2 de NCK2 (NCK1-SH2K2) devient partiellement capable de lier PKP4 endogène tandis que la liaison entre NCK2-SH2K1 et PKP4 endogène est fortement entravée par rapport à NCK2. Ainsi, la liaison partielle de PKP4 endogène avec NCK1-SH2K2 suggère que les

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domaines SH2 seuls de NCK1/2 et les déterminants moléculaires spécifiques qu’ils arborent ne sont pas complètement responsables de la spécificité.

En conclusion, j’ai identifié 17 acides aminés différents entre les domaines SH2 de NCK1 et NCK2 et entrepris l’identification d’un groupe de résidus régulant la spécificité de ces domaines. Toutefois, les expériences réalisées avec des protéines NCK1/2 aux domaines SH2 commutés suggère qu’un ou plusieurs éléments dans la structure globale de ces protéines pourraient moduler la spécificité de leurs domaines SH2 respectifs. Ainsi, le contexte dans lequel ces domaines se situent pourrait être un facteur clef dans la compréhension de leur spécificité respective.

3.4.2 Étude de l’implication des régions interdomaines dans la spécificité des