Quels que soient les modes de préparation protéique choisis, les protéines seront ensuite identifiées par spectrométrie de masse. La spectrométrie de masse est une technique qui repose sur la séparation des fragments peptidiques générés en fonction de leur masse moléculaire et de leur état de charge. L’analyse des fragments permet ensuite l’identification de leur séquence, puis celle des protéines dont ils sont issus. Pour cela le spectromètre de masse se compose de trois parties (Figure 46) : (1) une source d’ionisation qui confère une charge au fragment peptidique, (2) un analyseur de masse permettant de séparer ces fragments en fonction de leur rapport masse sur charge (m/Z), (3) un détecteur de courant d’ion générant le signal à traiter. Les données générées seront analysées par informatique sous forme d’un spectre de masse exprimant l’intensité du signal en fonction des rapports m/z (Görg et al. 2000).
Figure 46: Schéma des composants d’un spectromètre de masse.
2.3.1 L’ionisation
Cette étape consiste donc à vaporiser l’échantillon et à l’ioniser. De nombreux ionisateurs existent tels que les ionisations : électroniques, chimiques, par bombardement d’atomes rapides (FAB), par pression atmosphérique. Les ionisateurs dits doux, c’est-à-dire qui génèrent des ions plus stables sans induire de fragmentation peptide, sont les ionisateurs
MATERIELS ET METHODES Partie 2 Protéomique
- L’électronébulisation (ESI) : L’échantillon en solution est introduit dans un fin
capillaire à l’extrémité duquel est appliqué un haut potentiel électrique, conduisant ainsi à la séparation des charges positives et négatives (formation d’un cône de Taylor), puis à la formation de gouttelettes contenant les analytes chargés (nébulisation). Ces gouttelettes chargées traversent ensuite simultanément un gradient de champ électrique et un gradient de pression dans la direction de l’analyseur du spectromètre de masse. Ce transport provoque ainsi une diminution successive de la taille des gouttelettes par évaporation, jusqu’à l’émission des ions directement en phase gazeuse. Les ions ainsi formés sont alors entrainés vers l’analyseur où règne un vide poussé (Smith et al. 2007).
- Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) : L’échantillon est
cristallisé avec une matrice qui cristallise à température ambiante. Ces cristaux ainsi formés sont excités par un laser UV, la matrice absorbe les photons UV émis, s’excite et s’ionise. L’énergie absorbée par la matrice provoque sa dissociation et son passage en phase gazeuse. Les molécules de matrice ionisées transfèrent leur charge à l'échantillon. L'expansion de la matrice entraîne l'échantillon au sein de la phase gazeuse dense où il va finir de s'ioniser. Le nuage d’ions ainsi formé, sera émis vers l’analyseur et accéléré par des différences de potentiels (Chughtai & Heeren 2010).
2.3.2 L’analyseur
Celui-ci permet la séparation des ions produits en fonction du rapport m/z afin de les analyser individuellement. Plusieurs types d’analyseurs existent (Figure 47), ils se distinguent entre eux par leur résolution, leur sensibilité, leur rapidité de mesure … Le choix de l’analyseur dépendra donc des objectifs de l’étude : protéine unique ou plusieurs protéines, quantification ou non, taille des protéines, précision souhaitée… Il est possible également d’utiliser plusieurs analyseurs en tandem.
- L’analyseur quadripolaire : Il est constitué de 4 barres parallèles, disposées
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électriquement 2 à 2 et permettent de créer un champ électrique d’oscillation laissant passer certains rapports m/z d’ions alors que d’autres ions auront des trajectoires instables qui ne leur permettront pas d’atteindre le détecteur. Le quadripôle est donc un filtre de m/z, il est souvent couplé à d’autres analyseurs (Wright et al. 2012).
- Les analyseurs temps-de-vol (TOF) : L’analyse en temps de vol consiste à mesurer
le temps de passage d’un ion préalablement accéléré sur une distance donnée (Figure 47). La séparation des ions dépendra uniquement de la vitesse acquise lors de la phase d’accélération. Les ions de rapport m/z les plus petits parviendront au détecteur en premier, ceux avec le rapport m/z le plus grand en dernier (Glish & Vachet 2003).
- L’analyseur à piégeage d’ions : Cet analyseur est un quadripôle à 3 dimensions,
constitué de 2 électrodes « chapeau » et un électron annulaire (Figure 47). Le mouvement des ions en 3 dimensions à l’intérieur du piège dépend de la masse m de l’ion, ainsi que de sa charge z. Les ions sont dans un premier temps piégés à l’intérieur de la trappe puis éjectés sélectivement vers le détecteur en fonction de leur rapport m/z suite à une diminution progressive de la tension appliquée (Glish & Vachet 2003).
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2.3.3 L’identification des protéines
Deux modes sont possibles pour identifier les protéines : l’empreinte peptidique massique (ou « peptide mass fingerprint », PMF) et le séquençage par fragmentation MS/MS.
- L’empreinte peptidique massique (PMF) : Le PMF consiste à digérer une protéine
par une enzyme de spécificité connue et à mesurer la masse de chaque peptide à l’aide de spectromètre de masse (James et al. 1993). Les différentes masses expérimentales obtenues seront comparées aux masses théoriques des peptides
issues de la digestion in silico de l’ensemble des protéines contenues dans les
banques de données. Cette stratégie fait appel à des instruments de type MALDI-TOF ou ESI-analyseur. C’est la stratégie la plus simple et la plus rapide, cependant les séquences des protéines analysées doivent être répertoriées dans les banques de données. De plus les algorithmes de PMF sont basés sur l’hypothèse que les peptides analysés proviennent d’une seule protéine, cette méthode est donc applicable uniquement pour des mélanges simples avec peu de protéines. Seule une séparation en électrophorèse 2D est donc envisageable pour une telle analyse permettant d’avoir un échantillon avec un nombre limité de protéines (Rabilloud & Lelong 2011).
Compte tenu de ces limitations, la spectrométrie de masse en tandem s’est avérée plus intéressante à utiliser dans nos études.
- Fragmentation MS/MS : Le spectre obtenu par MS/MS permet d’obtenir des
informations de séquence sur les fragments protéiques analysés. Cette technique est utilisée lorsque l’empreinte PMF ne suffit pas. Les séquences ainsi obtenues seront comparées à une banque de données contenant l’ensemble des séquences des protéines connues (Yates et al. 1997).
Cette technique combine deux analyseurs. Les peptides issus de l’hydrolyse enzymatique des protéines vont dans un premier temps être séparés par chromatographie liquide. Les peptides arrivent séquentiellement dans le
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spectromètre de masse et vont être ionisés, où seuls les ions ayant un rapport m/z déterminé pourront sortir. Ces ions seront ensuite fragmentés dans une cellule de collision, puis analysés dans un second analyseur. Cette technique apporte des informations concernant la séquence de la protéine étudiée, car la fragmentation des peptides a lieu sur les liaisons chimiques entre les acides aminés et les « libère » de la chaîne peptidique, un par un ou en sous-fragments très courts. Le spectre obtenu en MS/MS permet de déterminer la séquence peptidique, en effet l’espace entre chaque fragment représente la masse d’un des 20 acides aminés (Figure 48).
Figure 48; Exemple d’interprétation d’un spectre MS/MS.
En abscisse, la masse des ions (plus exactement, le rapport masse/charge) ; en ordonnée, le pourcentage des ions possédant une masse donnée. En pratique, les espacements de m/z entre les pics les plus intenses correspondent aux masses des acides aminés, ce qui permet
de reconstituer la séquence peptidique. Sur cet exemple, la lecture du spectre de droite à gauche permet de reconstituer la séquence EWMPGQPR (chacun des 20 acides aminés est
ici désigné par un code d'une lettre). (Réalisé par : François Rechenmann et
Isabelle Quinkal , https://interstices.info/jcms/c_7463/la-bioinformatique-en-proteomique-analyse-des-spectres-de-masse, 2005).