La caractérisation phénotypique des souches isolées a été poursuivie grâce à des tests biochimiques, physiologiques, et morphologiques comparés par la suite, aux caractéristiques connues du « Bergey's Manual Of Systematic Bacteriology ». Les critères morphologiques regroupent les caractéristiques de la cellule bactérienne et les caractéristiques de la colonie. Les critères biochimiques évaluent la présence et/ou l‟activité des différentes enzymes tels que l‟oxydase, la nitrate réductase, l‟uréase, ainsi que d‟autres enzymes impliquées dans les voies métaboliques d‟assimilation des substrats carbonés. Les critères physiologiques comme la croissance à différentes températures, la tolérance aux variations du pH et aux différentes concentrations en sels.
Avant de procéder à l‟identification, les colonies obtenues ont été examinées morphologiquement (macroscopiquement : aspects des colonies) et microscopiquement (coloration du Gram et mobilité) pour en choisir des isolats représentatifs des formes distinctes. 7.1. Tests biochimiques et d’activité métabolique
7.1.1. Production de l’oxydase
A partir de cultures jeunes sur milieu solide, on prend une aliquote de colonie et on l‟étale sur le disque d‟oxydase. La lecture pendant les premiers 30 seconds. La présence du cytochrome oxydase se traduit par l'apparition d'une coloration rouge virant rapidement au violet très foncé. 7.1.2. Production de la catalase
La catalase a été révélée en déposant sur une lame en verre propre, une colonie bactérienne en présence de peroxyde d‟hydrogène (H2O2) à 10 volumes. La présence de la catalase se traduit, en quelques secondes, par l‟apparition de bulles, suite au dégagement gazeux d‟oxygène (Lévy et al., 1992).
7.1.3. Hydrolyse de l’urée
Le test de l‟hydrolyse de l‟urée est réalisé sur le milieu GN additionnée urée à 2% et un indicateur du pH (Rouge de phénol) (annexe 1). Après incubation, le virage de la couleur indique que le test est positif.
7.1.4. Recherche de la cellulase
L‟activité cellulolytique des isolats bactériens a été déterminée sur la GN additionnée le carboxymethyle cellulose (CMC) à 0.25%. Après 5 jours d‟incubation, les boites ont été rancies avec l‟eau puis colorées avec un 0,1% de solution de Rouge Congo et incubées 30 minutes dans l‟étuve. Les boites ont été ensuite décolorées avec une solution de chlorure de sodium à 1 M pendant 30 minutes à température ambiante. Le Rouge Congo se lie fortement aux chaînes de cellulose intactes mais peut être éliminé par lavage à partir des zones dans lesquelles les chaînes de cellulose ont été dégradées. Pour cela, les zones claires autour des zones de croissance bactérienne indiquent donc une activité cellulolytique (Joynson et al., 2014).
7.1.5. Utilisation du citrate
Ce test est réalisé par ensemencement du milieu citrate de Simmons en tubes de gélose inclinée qui est de couleur verte due à la présence de l‟indicateur coloré: le bleu de bromotymol. Après 5 jours d‟incubation, une croissance avec l‟apparition d‟une couleur bleue indique l‟utilisation du citrate avec production de bases (Wauters et al., 2005).
7.1.6. Réduction des nitrates
Les isolats sont inoculés dans le bouillon nitraté. Après 4 jours d‟incubation avec agitation à 28°C, 3 à 4 gouttes des réactifs du nitrate réductase (NR 1 et NR 2) sont ajoutés (Guiraud, 1998). La présence des nitrites est indiquée par l‟apparition d‟une couleur rouge. S‟il y a absence de nitrite, 4 à 5 mg de la poudre de zinc sont ajoutés aux tubes préalablement testés, le zinc réduit le nitrate s‟il est présent et donne une couleur rouge, si le test est négatif (pas de couleur rouge), donc la bactérie a réduit le nitrate en nitrites.
7.1.7. Recherche d’Ornithine (ODC), de la lysine décarboxylase(LDC) et de l’arginine dihydrolase (ADH)
Des tubes contenant les milieux d‟Ornithine, de la lysine, et de l‟arginine inoculés ont été recouverts d‟une couche de vaseline pour engendrer des conditions d‟anaérobiose et incubés à 28ºC pendant 5 jours. Une réaction positive se traduit par l‟apparition d‟une coloration pourpre suite à l‟alcalinisation du milieu (Hildebrand, 1988).
7.1.8. Production d’indole
La recherche d‟indole est examinée sur le milieu eau peptonée exempte d‟indole. Après l‟inoculation du milieu et l‟incubation, une couche du réactif de Kovacs a été ajoutée, puis agitée. L‟apparition d‟une couleur rouge indique la production d‟indole.
7.1.9. Réaction de Voges-Proskauer (VP) et le Rouge de Méthyle (RM)
Les isolats sont inoculés sur le milieu Clark et Labs. Après incubation, le milieu est divisé en deux dans un autre tube stérile pour faire les deux tests. Dans l‟un des tubes on a ajouté le rouge de méthyle pour le test RM, et dans l‟autre on a ajouté les réactif VP I et VP II pour le test VP. Un virage de couleur vers le rouge indique le test positif.
7.1.10. Assimilation des substrats carbonés
La capacité des isolats à utiliser les substrats carbonés comme seul source de carbone est déterminée par le milieu de base proposé par Larpent (1970) modifié (annexe 1). Les substrats testés sont les suivants : xylose, arabinose, saccharose, fructose, galactose, ribose, lactose, maltose, glucose et le sorbitol. Les boites ont été incubées à 28°C pendant 72 heures. Une croissance sur ce milieu indique l‟utilisation du sucre comme seul source de carbone.
7.1.11. Assimilation des acides aminés
Le pouvoir des isolats à se développer sur un milieu ne contenant que les acides aminés comme seul source d‟azote et carbone a été testé sur un milieu de base qui contient le KH2PO4
et le MgSO4 (annexe 1). Les acides aminés testés sont : valine, tyrosine, leucine, proline, thréonine, isoleucine, phénylalanine, tryptophane, lysine, glycine, sérine, histidine, arginine, méthionine, alanine, asparagine, glutamate de sodium, et cystéine. Après ensemencement des souches sur les milieux, une incubation à 28°C pendant 24 heures a été effectuée. S‟il n‟y avait pas de croissance après 24 heures, on aurait prolongé l‟incubation à 48 heures, et même à 72 heures.
7.2. Tests physiologiques
La croissance à différents pH, températures et différentes concentrations de NaCl a été examinée.
7.2.1. Tolérance au chlorure de sodium
La tolérance au chlorure de sodium est contrôlée sur le milieu bouillon nutritif préparé à partir de différentes concentrations allant de : 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 3%, 8% à 12%. Après 24
et 48 heures d‟incubation à 28°C, la mesure de la densité optique (DO) à 600 nm à l‟aide de spectrophotomètre a été effectuée.
7.2.2. Effet de la Température
Les différentes souches testées sont cultivées sur gélose nutritive et incubées aux températures suivantes : 4°C, 20°C, 30°C, 37°C, 45°C et 50°C. Les lectures sont effectuées après 24, 48, 72, heures d‟incubation. Pour la température 4°C, la lecture peut aller jusqu‟à 10 jours. 7.2.3. Effet du pH
Les souches sont cultivées sur le bouillon nutritif aux différents pH : 4, 5.5, 7, 8, 8.6, 9.5 et pH 11. Après incubation à 28°C pendant 24 et 48 heures, la mesure de la DO à 600nm.