Identification des isolats

L’identification des isolats bactériennes est réalisée par des examens macroscopique et microscopique et par l’étude de quelques caractères biochimiques.

III.3.1. Identification morphologique et culturale

III.3.1.1. Examen macroscopique

L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué après l’isolement, il consiste à observer directement, à l’œil nu, l’aspect morphologique des

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colonies obtenues sur milieu PCA, King A et King B après 24 à 48 heures d’incubation en tenant compte des critères suivants :

• La taille : Elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies. Il est possible aussi d'utiliser le microscope au grossissement le plus faible pour mesurer la taille des petites colonies en utilisant les micromètres oculaires. • La forme des colonies : Circulaire, filamenteuse, irrégulière, ronde, étoilée, etc. • Le relief : Plane, élevée, convexe, bombée, bossue, etc.

• Le bord : Régulier, ondulé, lobé, dentelé, filamenteux, bouclé, • L’aspect : Duveteux, poudreux, granuleux, etc.

• La consistance : Molle, élastique, cartonneuse, • La couleur de la culture et de son verso,

• L'opacité : Les colonies sont soit opaques et ne laissent pas passer la lumière, translucides en laissant passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers, comme le verre dépoli ou transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers) (Ripert, 2013).

III.3.1.2. Examen microscopique

L’observation microscopique permet de définir certains caractères morphologiques et organisationnels des bactéries.

III.3.1.2.1. Examen microscopique à l’état frais

L'état frais permet d'observer des bactéries vivantes et apporte des renseignements sur la morphologie, le mode de groupement, la mobilité et la quantité approximative de bactéries.

(Delarras et al., 2003). Pour cela, une goutte de la culture bactérienne en milieu liquide est déposée à l'aide d'une anse de platine préalablement stérilisée sur une lame propre. Dans le cas de culture bactérienne solide, il faut déposer tout d'abord sur la lame une goutte d'eau distillée stérile, puis y dissocier l’inoculum bactérien. La lame est ensuite recouverte d'une lamelle et l’observation se fait au microscope à l'objectif moyen ×40. Afin de mettre en évidence certains détails de structure, l'objectif ×100 à immersion est utilisé (Rejsek, 2002).

III.3.1.2.2. Coloration de Gram

C'est la coloration de référence en bactériologie. Elle est réalisée comme suit : Sur un frottis fixé à la chaleur ou à l'alcool, la lame est recouverte de violet de gentiane, après 1 minute, le colorant est rejeté, et la lame est recouverte de lugol pendant 1 minute puis il est rejeté, une décoloration à l'alcool est ensuite réalisée, la lame étant tenue inclinée, la durée de décoloration à l'alcool est variable selon l'épaisseur du frottis. En pratique, la durée de

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décoloration est suffisante lorsque ce qui s'écoule en bas de la lame inclinée devient clair, la décoloration est stoppée par un nouveau lavage à l'eau. La lame est recouverte ensuite de fuchsine diluée pendant 30 secondes à 1 minute puis lavée à l'eau et séchée entre deux feuilles de papier filtre, puis à la chaleur, elle est ensuite examinée à l'immersion.

Les bactéries à Gram positif doivent apparaître colorées en violet et les bactéries à Gram négatif en rose. (Lanotte et al., 2016a).

III.3.2. Tests biochimiques

III.3.2.1. Etude des enzymes respiratoires III.3.2.1.1. Recherche de la catalase

La catalase est une enzyme présente chez la plupart des bactéries aérobies strictes et anaérobies facultatifs. Elle décompose l’eau oxygénée (H2O2) provenant de la respiration oxydative, en eau et en oxygène qui se dégage (Marchal et al., 1982).

La recherche de la catalase se fait en suivant le protocole suivant : A l’aide d’une pipette pasteur une goutte d’eau oxygénée à 10 volumes est déposée au milieu d’une lame propre et dégraissée, avec une pipette boutonnée, un prélèvement à partir d’une culture pure de 18 heures est déposé sur l’eau oxygénée (Marchal et al., 1982). Le dégagement des bulles de gaz indique la présence de catalase. S’il n’y a pas de dégagement des bulles de gaz cela indique l’absence de la catalase.

III.3.2.1.2. Recherche de l’oxydase

C’est une enzyme qui intervient dans divers couples d’oxydoréduction, l’enzyme recherchée est la phénylène-diamine-oxydase, pour cela, un disque d’oxydase est déposé sur une lame, il est imbibé avec une goutte d’eau physiologique stérile. Puis une partie de la colonie à étudier y est étalée (Flandroits et Chomarat, 1988). Une coloration violet foncé apparait immédiatement sur le disque indiquant une oxydase positive. L’absence de coloration indique que l’oxydase est négative.

III.3.2.1.3. Recherche du nitrate réductase

Certaines bactéries peuvent utiliser les glucides en anaérobie en présence d’un accepteur d’hydrogène qui peut être l’ion NO-_{. Elles possèdent alors une enzyme spéciale : La} nitrate réductase qui catalyse la réduction des nitrates en nitrite et éventuellement en azote.

La recherche de cette enzyme se fait selon les étapes suivantes : Un tube de bouillon nitraté (bouillon nutritif supplément de 1,5% de nitrate de potassium) est ensemencé avec la bactérie a étudié, et est on incube à 37°C après une incubation de 18 à 24 heures, 3 gouttes du

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réactif sulfanilique + acide acétique (nitrate1) et 3 gouttes du réactif alpha-naphtylamine + acide acétique (nitrate2) sont rajouté (Frenry et al., 2007).

Une coloration rouge permet de dire qu’il y a présence de NO2 donc la bactérie est nitrate réductase positive. En absence de coloration une poudre de zinc est ajoutée, s’il y a coloration rouge ceci signifie que la poudre de zinc a réduit les nitrates en nitrites donc la bactérie est nitrate réductase négative, s’il n’y a pas de coloration ceci veut dire que la bactérie est nitrate réductase positive.

III.3.2.2. Etude du métabolisme glucidique III.3.2.2.1. Etude des différents sucres

• TSI (Tri Sugar Iron)

Ce complexe permet de confirmer la fermentation du glucose avec ou sans production de gaz et d’orienter l’identité du germe par l’étude de l’attaque du saccharose, lactose et la production d’H2. La fermentation des sucres entraine la production d’acides faisant virer au jaune l’indicateur du pH qui est le rouge de phénol. (Marchal et al., 1982). Pour cela, un ensemencement en stries serrées de la pente et par piqure centrale profonde le culot à l’aide d’une pipette pasteur ou d’une anse préalablement stérilisée. Les tubes sont incubés avec le bouchon non bien vissé (Marchal et al., 1982).

Au niveau du culot, s’il y a virage de la couleur vers le jaune ceci indique une fermentation du glucose. Un décollement de la gélose indique une production de gaz, un noircissement du milieu indique une production d’H2S.

Au niveau de la pente, si la pente est rouge, la bactérie est lactose négatif, saccharose négatif, dans le cas où la pente est jaune, la bactérie est dite lactose positif, saccharose positif.

• Etude de la dégradation du mannitol (test du mannitol mobilité)

Le milieu mannitol mobilité permet de détecter la fermentation du mannitol et la mobilité de la bactérie à étudier, pour ce faire, à l’aide d’une anse de platine les tubes sont ensemencés par piqure centrale dans la gélose en culot, jusqu’au fond et sont incubés à 37°C pendant 18 à 24 heures (Frenry et al., 2007).

Le virage au jaune indique que le mannitol est fermenté donc la bactérie est mannitol positif, alors que si le milieu reste rouge, la bactérie est dite mannitol négatif. S’il y a une diffusion des bactéries dans la gélose, la bactérie est mobile, si la culture est uniquement au niveau de la piqure d’ensemencement la bactérie n’est pas mobile (AFSSAPS, 2008).

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III.3.2.2.2. Voie d’attaque des glucides

Les bactéries utilisent les glucides suivant deux voies métaboliques : Une voie oxydative en présence d’oxygène de l’air et une voie fermentative en absence d’oxygène de l’air (Ferron, 1984). Afin de déterminer quelle voie est utilisé, deux tubes de MEVAG (Milieu pour l’Etude de la Voie d’Attaque des Glucides) sont ensemencés par piqure central jusqu’au fond avec une culture pure et jeune. L’un des tubes est recouvert d’une couche d’huile de vaseline stérile (Ferron, 1984). Un virage de la couleur au jaune dans les deux tubes démontre un métabolisme de fermentation, alors qu’une acidification uniquement de la partie supérieure du tube ouvert indique un métabolisme oxydatif.

III.3.2.2.3. Détermination de la voie de fermentation

La mise en évidence de la voie fermentaire empruntée par un germe est très importante. Elle consiste à différencier entre les deux voies de la fermentation des acides mixtes mise en évidence par le test RM (rouge de méthyle) et la voie butandiol mis en évidence par la réaction de Voges Proskauer (VP). Ce test consiste à utiliser le milieu Clark et Lubs qui est ensemencé avec une culture pure et incubé à 37°C. Après incubation de 24 heures, le milieu est réparti entre deux tubes, dans le premier tube, quelque goutte de RM est ajoutée alors que dans le deuxième tube on ajoute de la soude NaOH et de l'α-naphtol

(Marchal et al., 1982).

Une coloration rouge pour le premier tube (RM+) et une coloration jaune pour le deuxième (VP-) indiquent une fermentation acide mixte, alors qu’une coloration jaune pour le premier tube (RM-) et une coloration rouge pour le deuxième (VP+) indiquent une fermentation butandiolique.

III.3.2.2.4. Enzymes intervenant dans la dégradation des sucres

• Étude de la dégradation du lactose

Il s'agit de la recherche d'une bêta-galactosidase qui dégrade le lactose en galactose et glucose. En pratique, ce test utilise l'ortho-nitrophényl-galacto-pyranoside (ONPG) ou le paranitrophényl-galacto-pyranoside (PNPG). L'ONPG et le PNPG diffusent spontanément dans la bactérie (à la différence du lactose qui nécessite une perméase) et sont dégradés par la bêta-galactosidase en galactose et orthonitrophénol ou paranitrophénol respectivement, qui sont des composés jaunes. Ce test est inclus dans la plupart des galeries d'identification. Individuellement, il peut être réalisé en mettant en contact une suspension bactérienne épaisse en eau physiologique avec un disque d'ONPG. Après une mise à l'étuve à 37 °C pendant 18 heures, l'apparition d'une coloration jaune peut être observée (Lanotte et al., 2016b).

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III.3.3. Etude du métabolisme des protides

III.3.3.1. Recherche des décarboxylases

Trois décarboxylases sont fréquemment recherchées : La lysine décarboxylase (LDC),

l’ornithine décarboxylase (ODC) et l’arginine dihydrolase (ADH). Lorsque les bactéries possèdent ces enzymes, elles vont métaboliser les acides aminés en formant des amines. La recherche de ces décarboxylases se fait en ensemencent à l’aide d’une culture pure trois tubes de bouillons contenant l’acide aminé à étudier, une petite quantité de glucose et du pourpre de bromocrézol d’où la coloration violette du milieu. Après 18 heures d’incubation à 37°C, un milieu trouble de couleur violette correspond à une réaction positive et un milieu jaune correspond à une réaction négative (Lanotte et al., 2016b).

III.3.3.2. Recherche de la tryptophanase

La production d'indole par hydrolyse du tryptophane peut être déterminer en utilisant une culture de la souche à étudier âgée de 24 heures et l’ensemencer dans le milieu de Ferguson ou en eau peptonée dépourvue d'indole. L'indole produit donne une coloration rouge en présence du réactif de Kovacs (para-diméthylaminobenzaldéhyde + alcool isoamylique) ou du réactif de James. La formation d'un anneau rouge correspond à une réaction positive

(Lanotte et al., 2016b).

III.3.3.3. Recherche de désulfhydrases

Cette recherche est réalisée sur milieu de Kligler-Hajna. La dégradation des acides aminés soufrés conduit à la formation de groupements SH ou H2S qui se combinent avec le citrate de fer ammoniacal du milieu pour former du sulfure de fer noir (Lanotte et al.,

2016b).

III.3.4. Utilisation du citrate comme seule source de carbone

Les bactéries possédant une citrate perméase sont capables d’utiliser le citrate en induisant une alcalinisation du milieu. Dans ce test, le milieu citrate de Simmons est utilisé, il ne contient qu’une seule source de carbone (citrate) en plus d’un indicateur de pH (bleu de bromothymol). L’ensemencement se fait sur la moitié de la pente et la partie supérieure servira de témoin négatif. Après une incubation à 35°C pendant 18 heures, les observations suivantes sont faites :

Un virage du milieu du vert au bleu correspond à une dégradation du citrate, donc bactérie citrate positif

Milieu inchangé, donc la bactérie ne possède pas la perméase nécessaire pour l’utilisation du citrate (bactérie citrate négatif). (Marchal et al., 1982).

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Absence d’anneau rouge en surface indique que la bactérie est indole est négatif.

III.3.5. Les galeries Api

Le système API® BioMérieux (Appareillage et Procédé d’Identification) est une version miniaturisée et standardisée des techniques biochimiques conventionnelles pour l’identification des bactéries. Lorsqu’une suspension bactérienne de densité convenable est répartie dans les différentes alvéoles qui composent la micro -galerie (contenant de substrats déshydratés), les métabolites produits durant la période d’incubation se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par addition de réactifs. Elle permet l’identification d’une centaine de bacilles à Gram négatif dont les Entérobactéries. Elle comprend 20 tests biochimiques (annexe) (Anonyme 1).

III.3.6. Détermination de l’activité enzymatique

La détermination de la production de certaines enzymes est également utilisée afin d’identifier les bactéries. Le principe de ces tests est décrit ci-après.