Identification et caractérisation de la souche FSIS4

2-1-1- Identification morphologique

Les études macroscopique et microscopique approfondies de la souche (FSIS4) révèlent les caractères suivants (fig. 16) :

o Thalle à croissance extrêmement rapide sur PDA, Sabouraud et CYA à 45 °C et à 50 °C avec un diamètre de croissance de 6 à 7 cm au bout de 24 heures. En 48 heures, les souches envahissent la boite jusqu'au couvercle.

• Les autres caractères macroscopiques enregistrés sont

o Mycélium blanchâtre au début puis devient gris à noir lors de la sporulation, il est de 10 à 20 mm de longueur.

o Colonies laineuses cérébriformes et collent au couvercle de la boite de pétri o Absence de pigment avec un revers de colonie de couleur crémée

• L'étude microscopique ainsi que les mesures micrométriques effectuées ont révélé les observations suivantes

o Mycélium non septé ;

o Différenciation du mycélium en stolons et rhizoïdes ;

o Sporangiophores isolés ou par bouquet de 2 à 4 de 4 à 5 µm de diamètre ; o Sporocyste globuleux noir de 28 µm de diamètre ;

o Columelles globuleuses ;

o Rhizoïdes bruns situés en opposé du sporongiophore, peu ramifiés de 10 µm de longueur ;

o Spores anguleuses, brunes striées (3 à 5 µm de long) ; o Présence de clamydospores.

83

Figure 16 : Caractères macroscopiques et microscopiques de la souche FSIS4. A : Aspect des colonies avant sporulation sur milieu Sabouraud ; B : Aspect des colonies après sporulation sur milieu Sabouraud ; C : Revers de colonie ;

D : Aspect général de la souche FSIS4 (X250) ; E : Aspect des rhizoïdes (X250) ;

F : Sporongiophore en bouquet de 3 (X250) ; G : Mycélium non cloisonné (X250) ;

H et I : Aspect du sporongiospore et des spores (X400).

A B _C

D E

Chapitre 3 Résultats et discussions

84

Les différents caractères présentés par les souches FSIS4 se rapprochent beaucoup de ceux correspondant à la moisissure Rhizopus oryzae citées par plusieurs auteurs Domisch

et al. (1980) ; Botton et al. (1990) ; Boiron (1996) ; Campbell et al. (1996) ; Ellis (1998) ; Smith (2002) ; Larone (2011) et Dufresne (2014).

2-1-2- Séquençage des régions ITS1 et ITS2 de l’ADNr de la souche FSIS4

Le séquençage des produits PCR des régions ITS1 et ITS2 de l’ADNr de la souche FSIS4 permet d’obtenir deux séquences : la première d’une taille de 283 paires de bases (pb) pour ITS1 et la seconde d’une taille de 189 pb pour ITS2.

Les séquences obtenues sont comparées à la base de données GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) en utilisant la méthode de recherche Blast (Basic local

alignment search) afin de trouver des régions ayant des zones de similitude entre deux ou plusieurs séquences. Des alignements des séquences obtenues et des séquences de la base

de données NCBI sont effectués en utilisant le programme ClustalW (Thompson et al., 1994) qui est un programme d’alignement multiple de séquences. Les séquences ont montré une similitude de 99 % avec de nombreuses souches de Rhizopus oryzae (voir résultat du Blast en annexe 5). La séquence ITS1 est déposée dans GenBank de NCBI avec le numéro d’accès KU726976.1 (Accession No: KU726976.1) (annexe 6).

Sur la base des résultats du Blast, un arbre phylogénétique est ensuite construit par le logiciel MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) (fig. 17). Cet arbre permet d’établir des liens de parenté entre les espèces, à partir de l’analyse de séquences, par l’intermédiaire d’un

alignement multiple contrairement au Blast qui est basé sur un alignement local. La construction prend en compte les changements survenus au cours de l’évolution. L’arbre phylogénétique est construit en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance, basée sur la recherche de l’arbre optimal en attribuant une probabilité à chaque changement dans les séquences "Neighbor-Joining" (Saitou et Nei, 1987). La fiabilité et la robustesse de la topologie obtenue est évaluée par la méthode du Bootstrap qui met en évidence la proximité entre les différents taxons (Felsenstein, 1985). Les distances génétiques sont calculées en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance entre les souches (Tamura et al., 2013). Séquence obtenue avec l'amorce ITS5 pour ITS1

TAATTATGTTAAAGCGCCTTACCTTAGGGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTG CTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGA CCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGTACCCTTCAT AATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACA ATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAnCAAAGTGCGATAAC TAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATnnT

Séquence obtenue avec l'amorce ITS4 pour ITS2

TAGTTTGAAAGTTACTGGATTATACTCTTGTACTTTACTTCCnGGnnGAACC

AAAAAAAAAGATCCTGAGACCAGCGTAATATTCCTGCCTAGCAAGCCAGAC

AGAAAATCACACACATTTTAGGTGCTCACTGnAATAAAACAGCGATGCGACC

85

Figure 17 : L’arbre phylogénétique de Rhizopus oryzae FSIS4. 2-2- Caractérisation physiologique de Rhizopus oryzae FSIS4

2-2-1- Etude de la thermophilie

La croissance apicale de Rhizopus oryzae FSIS4 en fonction de la température d’incubation : 19, 25, 35, 45, 50, 55 et 60 °C, est récapitulée dans le tableau 15 suivant.

Tableau 15 : Croissance apicale (mm.h-1) de Rhizopus oryzae FSIS4 après incubation à différentes températures. Température (°C) Croissance apicale (mm.h-1) 19 0 25 0,1 ± 0,02 35 0,15 ± 0,07 45 1,08 ± 0,23 50 1,09 ± 0.18 55 0,97 ± 0.16 60 0.05 ± 0.02

Les résultats montrent que l’espèce isolée est capables de se développer dans une large

gamme de températures allant de 25 °C à 60 °C avec un optimum à 50 °C. Une absence de croissance à 19 °C et un développement au delà de 50 °C confirme que la souche isolée est thermophyle. Ces dernières sont fréquemment isolées de milieux extrêmes (Dix et Webster, 1995).

Chapitre 3 Résultats et discussions

86

2-2-2- Détermination du taux optimale de l’inoculum de Rhizopus oryzae FSIS4 Différents taux d’ensemencement (104, 105, 106 et 107 cellules/ml) sont testés pour

déterminer le taux optimal pour la production de l’α-amylase de Rhizopus oryzae FSIS4. Les résultats montrent que la production de l’α-amylase augmente en fonction de l’augmentation du taux de spores jusqu'à 106 cellules/ml. Pour le dernier taux testé (107),

la production diminue considérablement pour atteindre en moyenne 3517,8 UI (fig. 18). L’Anova effectuée révèle un effet taux de spores hautement significatif sur la production de l’enzyme (F = 26,56 ; p < 0,001). D’après le test post-hoc de Student-Newman-Keuls,

l’activité amylasique la plus importante est enregistrée avec le taux de spores de 106 cellules/mL ce qui correspond au taux optimal, retenu pour toutes les fermentations

ultérieures.

Le même taux de spores est recommandé par plusieurs auteurs pour la production d’α- amylase fongique (Bennamoun et al., 2004 ; Djekrif et al., 2006 et Ait Kaki – El-Hadef

El-Okki et al., 2012).

2-2-3- Effet de la température sur la germination des spores

La germination des spores des champignons filamenteux est conditionnée par la somme des changements morphologiques et biochimiques qui interviennent lors de la reprise du développement du mycélium. L’effet de la température sur la germination et le métabolisme des moisissures est démontré par plusieurs auteurs (Roussos, 1985;Maheshwari et al., 2000 et Carlile et al., 2001). De ce fait, l’effet de différentes températures sur la germination des spores de R. oryzae FSIS4 est étudié.

La figure 19 montre l’effet de la température d’incubation sur le taux de germinations des spores de R.oryzae FSIS4. Cette dernière présente une bonne germination à 45 °C, à 50 °C et à 60 °C avec un optimum à 45 °C, contrairement à 30 °C et à 19 °C où la germination devient moins rapide. Ces résultats montrent qu’effectivement la température influence la germination et sa vitesse (Carlile et al., 2001)

87

Médiane 25%-75% Min-Max

104 105 106 107

Taux de spores (cellules/ml) 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 A ct iv ité a m yl as iq ue ( U I)

Figure 18 : L’activité amylasique en fonction du taux de spores. a,b,c: groupes homogènes selon le test post-hoc de Student-Newman-Keuls

Figure 19 : Influence de la température d’incubation sur le taux de germinations des spores de Rhizopus oryzae FSIS4.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4 6 8 10 12 14 Ta ux d e ge rm in atio n (%) Temps (heure) 19 °C 30 °C 45 °C 50 °C 60 °C 104 105 106 107 a b c a

Chapitre 3 Résultats et discussions

88