I.1 Origine géographique des microalgues
La majorité des microalgues sur lesquelles porte cette étude ont été collectées dans la baie de Bourgneuf (côte atlantique française) au climat tempéré. Les microalgues comprenant les diatomées ont été isolées par les collègues de Nantes et sont conservées en culture dans l‟algothèque du Laboratoire Mer Molécules Santé (MMS) de Nantes et du Mans. Deux autres espèces diatomées proviennent de la côte sud-Est du Vietnam au climat tropical. Elles ont été collectées sur le site de Can Gio situé dans une mangrove, et ont été isolées par T.L.N. Nguyen-Deroche.
I.2 Les microalgues
Une collection de 18 microalgues est entretenue et conservée au laboratoire dont 15 espèces de microalgues appartiennent à la classe des Bacillariophycées (ou diatomées). Parmi les 15 espèces de diatomées, 11 d‟entre elles sont des diatomées pennales, les quatre autres espèces sont des centrales. Deux espèces de microalgues dites «vertes» appartenant respectivement aux classes des Prymnésiophycées et Pavlovophycées et une espèce de microalgue rouge (Rhodophycée) ont été ajoutées à cet échantillon. Toutes les microalgues ont été utilisées dans un premier temps pour la recherche des transposons. La liste des espèces étudiées, leur origine, leur intérêt écologique ou/et économique sont présentés dans le Tableau 4.
Tableau 4 : Liste des espèces utilisées, leur taxonomie, leur origine géographique et leur intérêt économique ou écologique.
Classe Ordre Espèce Origine Intérêt
Bacillariophycées (diatomées)
Pennales Amphora acutiuscula Côte vietnamienne Espèce tropicale Pennales Amphora
coffeaeformis
Côte atlantique
française Espèce tempérée Pennales Cylindrotheca
fusifomis
Côte atlantique
française Peu silicifiée, frustule fin Pennales Cylindrotheca
closterium
Côte atlantique
française Peu silicifiée, frustule fin Pennales Entomoneis paludosa Côte atlantique
française Espèce cosmopolite, benthique Pennales Nitzschia laevis Côte atlantique
française Aquaculture Pennales Nitzschia palea Côte vietnamienne Espèce tropicale
I.3 Conditions de culture de référence
Les microalgues sont cultivées dans une chambre de culture en conditions contrôlées. Toutes les cultures sont monoclonales et axéniques (c'est-à-dire dépourvues de micro- organismes contaminants) (Annexe 1). Les microalgues sont cultivées dans des fioles erlenmeyer renfermant de l‟eau de mer artificielle (EMA) qui ne sont ni aérées, ni agitées (culture en Batch). L‟EMA est préparée selon le protocole de Harrison et al. (1980) modifié par l‟ajout de micro-éléments et vitamines avant autoclavage (Annexe 2). Toutes les espèces sont cultivées dans ce milieu à l‟exception des deux espèces du genre Amphora qui sont cultivées dans un milieu EMA à teneur réduite en calcium (0,25 mM CaCl2 au lieu de 9 mM)
permettant de limiter l‟adhésion des cellules entre elles et aux parois de l‟erlenmeyer (Cooskey et al., 1981; Molino et al., 2008).
Les microalgues du littoral atlantique français adaptées à un milieu tempéré sont cultivées à une température de 16 ± 1 °C tandis que les espèces d‟origine vietnamienne sont cultivées à une température de 24 ± 1 °C.
Pennales Phaeodactyllum tricornutum
Côte atlantique française
Génome séquencé, benthique ou planctonique
Pennales Stauroneis constricta Côte atlantique
française Espèce cosmopolite Pennales Haslea crucigera Côte atlantique
française Abscence de marennine Pennales Haslea ostrearia Côte atlantique
française
Marennine responsable du verdissement des huîtres Centrales Thalassiosira
pseudonana Long island Génome séquencé, planctonique Centrales Thalassiosira
weissflogii Long island Planctonique Centrales Odontella aurita Côte atlantique
française
Produit des omega 3 Frustule avec épines Centrales Skeletonema costatum Côte atlantique française Aquaculture Rhodophycée Porphyridium cruentum Côte atlantique
française Propriétés antioxydantes Prymnésiophycée Isochrysis galbana Port Erin, Isle of Man,
Irish Sea Aquaculture; lipides Pavlovophycée Pavlova lutheri Côte atlantique
Les cultures sont réalisées sous un éclairement de 100 µmol de photons m-2s-1avec une photopériode de 14 h. La mesure du niveau d‟éclairement est effectuée avec une sonde quantamétrique 4(Walz, Allemagne) reliée à un quantamètre (Li-cor 189) et immergée dans le milieu de culture.
Le repiquage des souches est effectué tous les 10 jours en inoculant 5 mL de la culture mère dans 120 mL de milieu EMA neuf. Les algues sont ainsi maintenues en phase exponentielle de croissance.
I.4 Stress thermiques
I.4.1 Conditions de stress thermiques
Les stress thermiques ont été appliqués à trois diatomées : P. tricornutum, A.
coffeaeformis usuellement cultivée à 16 °C et A. acutiuscula cultivée à 24 °C.
I.4.2 Détermination des températures de stress thermiques
Après 8 jours de croissance en conditions standards, les trois espèces ont été mises en culture dans 125 mL d‟EMA et placées pendant 10 jours à 8, 16 ou 24 °C. Ces cultures ont servi au suivi de la cinétique de croissance permettant de déterminer les températures de stress.
I.4.3 Application de stress thermiques de courte durée
A partir de ces cultures axéniques, pour chacune des espèces, cinq nouvelles cultures ont été réalisées dans 125 mL d‟EMA, chacune avec une densité initiale de 5.104
cellules par mL. Pour accélérer la croissance, les cultures ont été placées sous un éclairement de 300 μmol photons m-2 s-1 et une photopériode de 14h pendant 8 jours à la température habituelle de culture (témoin) : 16 °C pour P. tricornutum et A. coffeaeformis et 24 °C pour A. acutiuscula.
Une vérification du niveau d‟éclairement a été réalisée au début de chaque série d‟essais. Les cultures n‟ont été ni agitées ni aérées pour éviter toute contamination.
Au 8ième jour, soit en fin en phase exponentielle de croissance, des stress de courte durée 5h ont été appliquées aux trois espèces de diatomées. Les cultures ont été placées pendant 5h dans des bains-cryothermostatés (Figure 23). Les conditions de stress thermiques sont 4, 8, 24 et 32 °C pour P. tricornutum et A. coffeaeformis, 16 °C étant la condition témoin. Pour A. acutiuscula, originaire du Vietnam, la température de culture est 24 °C et les conditions de stress sont 4, 8, 16 et 32 °C.
Figure 23 : Dispositif expérimental utilisé pour appliquer les stress thermiques aux trois diatomées Phaeodactylum tricornutum, Amphora coffeaeformis et Amphora acutiuscula.
A : Schéma du protocole expérimental utilisé pour l‟application des stress thermiques aux trois diatomées Les flocons bleus symbolisent les stress basse température et les éclairs jaunes symbolisent les stress température élevée par rapport à la température de culture noté T.
B : Dispositif expérimental mis en place pour l‟application des stress thermiques.
Ici les cultures de Phaeodactylum tricornutum sont soumises aux différents stress thermiques (4, 8, 16, 24 et 32 °C). Au premier plan, la culture de P. tricornutum soumise à une température de 8 °C pendant 5 h par immersion dans un bain thermostaté.
Amphora coffeaeformis Phaeodactylum tricornutum Amphora acutiuscula Temps (j) Phase exponentielle de croissance j8 Stress 5h Phase stationnaire