La formation du bois est un processus développemental complexe qui requiert la contribution de plusieurs milliers de gènes nécessaires au contrôle de l'activité cambiale et de la différenciation des cellules du xylème. L'ensemble de ces gènes est régulé par des signaux endogènes faisant intervenir un réseau complexe de FT, qui n'est que partiellement décrypté. Les données disponibles dans la littérature suggèrent que des contraintes environnementales pourraient agir en tant que signaux exogènes capables d’influencer la xylogénèse et de permettre l'adaptation des arbres à leur environnement. Cette réponse pourrait impliquer des gènes régulateurs se trouvant à l'interface entre les voies de réponse aux stress et les mécanismes assurant la formation du bois.
Dans le contexte de changement climatique, il est prédit une augmentation de l'occurrence des épisodes prolongés de sécheresse et/ou de froid. Or ce sont les principales contraintes environnementales qui affectent la croissance de l'Eucalyptus, et par conséquent son exploitation. Étant donné l'importance économique que représente l'Eucalyptus, il apparaissait essentiel d'évaluer l'impact de ces stress sur la formation du bois, pour que ces informations soient prises en compte lors de la sélection de nouveaux génotypes.
Les objectifs de mon projet de thèse étaient :
(1) de caractériser l'effet de stress abiotiques sur la composition et la structure du bois; (2) d’analyser et de comprendre les régulations qui sont impliqués dans le remodelage
de la paroi secondaire en réponse à ces stress, pour identifier les régulateurs clés impliqués dans cette réponse;
(3) caractériser la fonction de ces régulateurs dans la formation du bois.
Pour répondre à ces ob ectifs, ’ai mis en place les stratégies suivantes :
(1) L’étude de jeunes Eucalyptus en conditions contrôlées et d’arbres au champ soumis à des températures basses, des restrictions d’eau ou de nutriments;
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(2) L’intégration de données globales par des approches de réseaux de corrélation afin de mettre en évidence les gènes potentiellement impliqués dans les réponses observées;
(3) La caractérisation fonctionnelle de ces gènes candidats en les surexprimant chez le peuplier ou l’Eucalyptus.
Ces stratégies sont décrites plus en détails dans les paragraphes 6.1 et 6.2 ci-dessous.
6.1. Analyse des réseaux de régulation impliqués dans le contrôle de la formation du bois en conditions de stress abiotiques
6.1.1. Caractérisation de l'effet du froid sur la formation du bois chez E. gundal
Les données de la littérature, ainsi que les résultats préliminaires obtenus dans l'équipe, suggéraient des modifications dans la dynamique de formation du xylème, ainsi que dans le métabolisme de la paroi secondaire en réponse au froid. Mon premier objectif a donc été d'analyser les changements dans la structure et la composition du xylème secondaire, par des techniques d'histochimie et des dosages de lignine (klason, thioacidolyse), sur des tiges de clones d'E. gundal soumis à une exposition au froid prolongée, en conditions contrôlées ou au champ. J’ai pu constater une modification des mécanismes de différentiation des cellules du xylème localisées sous le cambium en réponse au froid, qui se traduisaient par des modification profonde du dépôt de la paroi secondaire.
Afin de renforcer ces observations, ’ai analysé l'expression des gènes (RT-qPCR) encodant des enzymes impliquées dans la biosynthèse des différents composants de la paroi secondaire ainsi que des FT régulant la formation de la paroi (principalement de types MYB et NAC).
Enfin, à partir de données d'expression de plus de 250 gènes dans plus de 30 conditions différentes (incluant différents tissus et différentes conditions de stress), acquises avant mon arrivée dans l’équipe, ’ai généré des réseaux de co-régulation afin de mettre en évidence les FT potentiellement impliqués dans les réponses observées en condition de stress froid. Une vingtaine de gènes MYB, dépourvus d’orthologues proches chez Arabidopsis et n’ayant amais été caractérisés dans d’autres espèces, sont ressortis de cette étude.
Cette approche, présentée dans le Chapitre I, a fait l'objet d'une publication récemment acceptée dans la revue internationale à comité de lecture "Tree Physiology".
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6.1.2. Caractérisation de l'effet de la sécheresse combinée à différents régimes nutritifs sur la formation du bois chez E. grandis
La première partie de ma thèse a révélé plusieurs FT régulés par le froid et potentiellement impliqués dans des mécanismes de régulation de la formation du bois en réponse à ce stress. Les données obtenues dans l'équipe avant mon arrivée, suggéraient que certains de ces FT répondaient également à d’autres stress abiotiques tels que la sécheresse, le stress mécanique ou l’apport en nutriments azotés. Par conséquent, 'ai voulu déterminer si une partie des mécanismes régulant la formation du bois n’étaient pas communs à plusieurs stress et s’il serait possible d’identifier les régulations concernées, au niveau transcriptionnel et métabolique.
Au travers d’une collaboration avec le CIRAD de Montpellier et un laboratoire Brésilien de l’université de ao Paulo, ’ai eu l’opportunité de partir pendant 3 mois au Brésil pour analyser la formation du bois d’Eucalyptus soumis à des stress abiotiques, dans le cadre d’un système expérimental unique au monde.
Dans ce système, des clones d'E. grandis ont été soumis à une exclusion de l'eau de pluie (de 33%) conduisant à une sécheresse modérée, combinée à différents régimes nutritifs (fertilisation minimale, fertilisation au potassium, fertilisation au sodium). J’avais pour objectif de caractériser les modifications induites dans la composition et la structure du xylème de ces arbres, par des approches de microscopie et de dosage biochimiques (teneur en lignine, rendement de saccharification), combinées à des analyses transcriptomiques et métabolomiques. Profondément impliqué dans le projet Agropolis-Capes, visant à intégrer des données globales de transcriptomique, de métabolomique et d’écophysiologie obtenues sur ces arbres, ’ai, dans un second temps, développé des approches de biologie des systèmes dans le but d'identifier des FTs impliqués dans le contrôle de la formation du bois en réponse au manque d'eau et à la fertilisation. Cette étude, présentée dans le Chapitre II, décrit l’effet combiné de la restriction d’eau et de la fertilisation au potassium sur le dépôt de paroi et son impact sur les propriété physico-chimique du bois. Un réseau complexe de FTs, dont certains sont communs avec la première partie de mon étude, a révélé des gènes candidats dont la caractérisation fonctionnelle suggère un rôle central dans la formation du bois en condition de stress abiotiques.
L'ensemble de ces résultats, présentés sous forme de manuscrit d’article (Chapitre II), doit être valorisé très prochainement.
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6.2. Caractérisation fonctionnelle de facteurs de transcription impliqués dans la régulation de la formation du bois en condition de stress abiotiques
Les deux approches présentées précédemment devaient permettre l'identification de FT candidats non caractérisés et potentiellement impliqués dans le contrôle de la formation du bois en condition de stress. Durant mon doctorat, j'ai entamé la caractérisation fonctionnelle de ces candidats dans des lignées de plantes transgéniques. La transformation de l’Eucalyptus étant longue et fastidieuse, nous avons choisi de sur-exprimer les gènes candidats dans un système hétérologue, chez le peuplier, ou dans un système homologue, des racines transgéniques d’Eucalyptus. En effet, ’ai pu bénéficier d’une technique récemment mise en place au sein de l’équipe visant à développer un système de transformation stable, efficace et rapide, afin procéder à la caractérisation fonctionnelle de gènes d’intérêt potentiellement impliqués dans la formation du bois chez l’Eucalyptus. Cette technique consiste à transformer des plantules d'E. grandis par A. rhizogenes, générant ainsi des racines transgéniques sur- exprimant le gène cible. Il est alors possible d’étudier, dans ces racines, le développement du xylème qui est analogue à celui observé dans la tige.
Cinq gènes de la famille des MYB-R2R3 ont été choisis : EgMYB20, EgMYB36,
EgMYB64, EgMYB68 et EgMYB137. La fonction de ces gènes étant totalement inconnue,
mon premier ob ectif a été d’analyser l'expression spatio-temporelle de leur promoteur fusionné au gène rapporteur encodant le gène GU (β-glucuronidase). Le deuxième objectif était de tester la capacité de ces gènes à réguler la formation du bois via l'analyse de la croissance, de la structure, de la composition ainsi que l’expression de gènes impliqués dans la formation du bois, dans la tige ou les racines de lignées sur-exprimant ces gènes candidats.
Les résultats concernant EgMYB137 ont été intégrés dans le projet de publication du Chapitre II. Les observations réalisées sur les gènes EgMYB20, EgMYB36, EgMYB64 et EgMYB68, sont présentées dans le Chapitre III.
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