Para ser competitivo o uso de enzimas, a sua reutilização é uma necessidade, e apesar de boas produtividades serem reportadas em exemplos da literatura empregando enzimas livres, os experimentos são conduzidos em regime de batelada de uso único, sem tentativas de recuperação da atividade enzimática (Nielsen, Brask et al., 2008). A imobilização consiste no confinamento da enzima em um suporte sólido para posterior reutilização do biocatalisador, tornando o processo menos oneroso (Guisan, 2006). Desta forma, pode-se considerar que a vantagem fundamental das enzimas imobilizadas é que elas podem ser recuperadas e reutilizadas após um processo batelada, por filtração simples. Além disso, o empacotamento de enzimas imobilizadas em colunas permite uma fácil implementação do processo contínuo. Deve ser levado em conta que a imobilização da enzima tem um efeito benéfico na estabilidade da enzima, em função das interações físicas e químicas entre o suporte e as moléculas da enzima. A imobilização também auxilia na dispersão homogênea da enzima no meio, o que é essencial para a condução de reações enzimáticas em meio não aquoso (De Castro e Anderson, 1995;
Balcao, Paiva et al., 1996; Villeneuve, Muderhwa et al., 2000). As principais desvantagens deste processo são: alteração da conformação nativa da enzima, custo do suporte e perda de atividade durante o processo de imobilização (Arroyo, 1998).
Enzimas podem ser imobilizadas de muitas maneiras. Podem ser imersas em gel ou microcápsulas; podem ser adsorvidas em materiais insolúveis como resinas de troca iônica; podem ser copolimerizadas com algum monômero; podem se ligar a uma matriz polimérica insolúvel e ainda por ligações covalentes (Villeneuve, Muderhwa et al., 2000; Dalla-Vecchia, Nascimento et al., 2004). Diversos trabalhos encontrados na literatura tratam das diferentes técnicas de imobilização de lipases, caracterização dos complexos ativados e aplicações em reações que se processam em meio aquoso e não-aquoso, como os abordados nas revisões abrangentes publicadas por Jeganathan, Abang et al. (2008) e Ognjanovic, Bezbradica e Knezevic-Jugovic (2009) e nos capítulos publicados por Zanin e Morais (2004) e De Castro, Zanin et al. (2008).
A imobilização é considerada como uma abordagem para otimizar a performance operacional de enzimas em processos industriais, especialmente para sistemas não-aquosos. Várias abordagens têm sido utilizadas para a imobilização de lipases para a síntese de biodiesel, incluindo a adsorção (Noureddini, Gao et al., 2005; Gao, Tan et al., 2006), a encapsulação (Noureddini, Gao et al., 2005), imobilização covalente em um suporte (Mahabubur, Talukder et al., 2006), bem como a imobilização livre de suporte, por exemplo, granulados de enzima cross-linked (CLEAs) (Shah, Sharma et al., 2006), cristais de enzima cross-linked (CLECs) (Lee, Vaghjiani et al., 2000) e micro cristais revestidos de proteína (PCMCs) (Kreiner, Moore et al., 2001; Kreiner, Fernandes et al., 2005).
Estudos comparativos mostram diferenças acentuadas no desempenho de lipases imobilizadas nos vários suportes, e evidenciam que apesar das várias experiências reportadas na literatura, a imobilização de lipases ainda é um desafio complexo, uma vez que a extensão da imobilização depende da estrutura da enzima, método de imobilização, e do tipo de suporte. Em muitos casos, suportes que proporcionam uma elevada atividade e estabilidade da enzima apresentam sérias limitações de resistência mecânica e de queda de pressão, que os tornam inviáveis para a utilização em alguns tipos de reatores (Yahya,
Anderson et al., 1998).
As mais recentes tecnologias de imobilização de enzimas requerem materiais com combinação de propriedades que não são encontradas nos materiais convencionais. Materiais híbridos orgânico-inorgânico são preparados pela combinação de componentes orgânicos e inorgânicos e constituem uma alternativa para a produção de novos materiais multifuncionais, com uma larga faixa de aplicações.
Diferentes materiais naturais, sintéticos orgânicos, inorgânicos e híbridos com distintas características de tamanho, forma e densidade têm sido empregados para a imobilização de lipases. Entre esses, matrizes híbridas de natureza orgânica e inorgânica têm apresentado particular interesse comercial nos últimos anos, devido às suas diferentes características e aplicações. Diversos compostos orgânicos têm sido empregados na síntese destas matrizes, porém os biopolímeros se mostram promissores devido ao seu baixo custo, baixa toxicidade, biocompatibilidade e propriedades multifuncionais (Cazacu, Dragan et al., 2003; Retuert, Quijada et al., 2003; Shchipunov, 2003; Freitas, Da Ros et al., 2009; Xie, Yu et al., 2009; Simões, Mori et al., 2010). Precursores silanos, tais como tetraetilortossilicato (TEOS) (Santos, Paula, et al., 2008; Smitha, Shajesh et al., 2008) e tetrametilortossilicato (TMOS) (Cazacu, Dragan et al., 2003; Retuert, Quijada et al., 2003) têm sido amplamente empregados na síntese de matrizes híbridas e a biocompatibilidade destes precursores com diversos polímeros, tais como álcool polivinílico (Freitas, Santos et al., 2010), celulose (Xie, Yu et al., 2009), carragenana (Shchipunov, 2003) e quitosana (Smitha, Shajesh et al., 2008; Simões, Mori et al., 2010).
Independentemente da estratégia utilizada para preparar uma matriz híbrida, o processo sol-gel é, indiscutivelmente, o mais empregado. O processo sol-gel envolve diversas variáveis, como tempo e temperatura da reação, natureza do catalisador, concentração de reagentes, entre outros. Estas variáveis determinam as características finais dos materiais, além disso, aditivos químicos podem ser usados para melhorar o processo e obter materiais com melhores propriedades, o que possibilita modificações nas propriedades mecânicas, controle de porosidade e ajuste no balanço hidrofílico/hidrofóbico (Gill e Ballesteros, 1998; Jose e Prado, 2005). Materiais sol-gel têm
sido empregados como suporte para a imobilização de enzimas tanto por encapsulação (Reetz, Zonta et al., 1996; Soares, Dos Santos et al., 2006) como por ligação covalente (Reetz, Zonta et al., 1998; Bruno, De Lima et al., 2004).
Recentemente, foi testada com sucesso uma matriz híbrida constituída de polissiloxano - álcool polivinílico (SiO2-
PVA) para imobilização de lipases de diferentes fontes: Mucor miehei (Bruno, De Lima et al., 2004; Bruno, Coelho et al., 2005), pancreática (Paula, Barboza et al., 2005; Paula, Urioste et al., 2007), Pseudomonas fluorescens (Moreira, Perez et al., 2007; Santos, Paula, Nunes et al., 2008), Candida antarctica (Freitas, Perez et al., 2007; Paula, Moreira et al., 2008), Thermomyces lanuginosus, Burkholderia cepacia e Penicillium camembertii (Moreira, Perez et al., 2007; Freitas, Da Ros et al., 2009; Freitas, Santos et al., 2010).
A matriz híbrida SiO2-PVA é obtida pela técnica sol-gel, a
partir de tetraetilortossilicato (TEOS) e álcool polivinílico (PVA). O produto resultante, polissiloxano – álcool polivinílico (SiO2-PVA) é
um composto que combina atributos físico-químicos de material orgânico e inorgânico (Bruno, Coelho et al., 2005). As vantagens da técnica sol-gel são a homogeneidade e pureza dos géis formados, bem como temperatura de síntese relativamente baixa. Esta técnica é um excelente método para preparação de materiais híbridos. A baixa temperatura da síntese possibilita que espécies orgânicas ou inorgânicas sejam incorporadas em uma matriz rígida de óxido de silicone sem que ocorra degradação (Barros, Almeida et al., 2002). Por apresentar atributos híbridos, essa matriz (SiO2-PVA) permite a manipulação da hidrofilicidade
e hidrofobicidade, capacidade tamponante, condutividade elétrica, carga iônica, porosidade e propriedades mecânicas em geral (Gill e Ballesteros, 1998), bem como elevada atividade e estabilidade.
Para o desenvolvimento deste trabalho, foram utilizadas duas lipases: a Novozym® 435 e a Lipase AK. A Novozym® 435 é uma lipase produzida por cultura submersa e adsorvida sobre resina acrílica. A lipase atua, não especificamente, nas 3 posições do TAG. Apresenta tamanho de partícula entre 0,3 e 0,9 mm, massa específica de aproximadamente 0,40 g mL-1 e conteúdo de água entre 1 e 2%. É uma lipase termoestável com uma atividade ótima na faixa de temperatura entre 70 e 80 °C (Novozymes, 2007). É descrita na literatura como o
biocatalisador mais efetivo para síntese de biodiesel a partir de diferentes óleos vegetais e diferentes agentes acilantes como metanol e etanol (Shimada, Watanabe et al., 2002; Du, Xu et al., 2004).
A Lipase AK é uma preparação enzimática produzida por um processo de cultura de uma estirpe selecionada de Pseudomonas fluorescens e tem uma alta atividade lipolítica. Esta lipase apresenta pH ótimo 8 e temperatura ótima de 60 °C. A solução de lipase AK é estável em uma ampla faixa de pH (4 a 10) e em temperaturas inferiores a 70 °C (Amano, 2008).