Durante 30, 60 e 90 dias de imersão, o monitoramento dos micro-organismos planctônicos foi realizado na água doce e no óleo Diesel S10. Além da quantificação dos micro-organismos sésseis presentes no biofilme aderido à superfície metálica fez-se necessário quantificar os micro-organismos sésseis no resíduo depositado no fundo do reator, após 90 dias de imersão em sistema bifásico.
Neste trabalho, os micro-organismos aeróbios e anaeróbios foram quantificados e os resultados foram expressos, respectivamente, em Unidade Formadora de Colônias (UFC) e em Número Mais Provável (NMP).
Todos os meios destinados para quantificação de micro-organismos aeróbios foram distribuídos em tubos de ensaio estéreis e tampados com algodão. Para os micro-organismos anaeróbios, todas as soluções e meios foram purgados com nitrogênio para obtenção de condição de anaerobiose. Os micro-organismos anaeróbios foram acondicionados em frascos de penicilina, tampados e lacrados. Todos os tubos e meios foram autoclavados, em uma autoclave da marca Prismatec, modelo Autoclave Vertical CS, à pressão de 1atm e à temperatura de 121°C, por 15 minutos. Ao retirar os meios da autoclave, foi preciso agitá-los para homogeneização completa.
3.7.1 Produção dos diluentes para os meios de cultura aeróbios e anaeróbios
Os micro-organismos aeróbios foram quantificados com a diluição em solução salina de 0,85% NaCl, enquanto que os anaeróbios foram quantificados em solução redutora.
A solução redutora foi preparada, pesando-se os reagentes, separadamente, em uma balança semianalítica da marca Shimadzu, modelo BL3200H. Após homogeneizar até completa dissolução, ajustou-se o pH para 7,2 0,2 com solução de NaOH 1N. A solução redutora foi purgada com N2, à vazão de 7 L/min, durante 20 minutos.
Composição química da solução redutora em g/L: 0,124 de tioglicolato de sódio (C2H3NaO2S); 2,5 de extrato de levedura; 0,1 de ácido ascórbico (C6H8O6); 8,5 de cloreto de
sódio (NaCl); além de 4 mL de resazurina (C12H6NNaO4) (0,025%).
3.7.2 Quantificação de bactérias aeróbias totais
As bactérias aeróbias totais foram quantificadas por contagem de Unidade Formadora de Colônias (UFC) em meio de cultura Plate Count Agar (PCA) desidratado (Merck, Darmstadt, Germany), empregando a técnica Pour Plate, após 48 horas de incubação a 35 ± 1ºC, em incubadora arrefecida, da marca Panasonic, modelo MIR-254. Após homogeneização, ajustou-se o pH para 7,0 0,2.
Composição química do meio de cultura PCA em g/L: 5,0 de peptona de caseína; 2,5 de extrato de levedura; 1,0 de glicose e 14,0 de agar.
3.7.3 Quantificação de bactérias aeróbias produtoras de ácidos
As bactérias aeróbias produtoras de ácidos foram quantificadas pela técnica de Número Mais Provável (NMP), em meio caldo vermelho de fenol desidratado (Himedia, Mumbai, Índia), suplementado com 1% de sacarose, após 48h de incubação, à 35 1 °C. Após homogeneização, ajustou-se o pH para 7,4 ± 0,2.
Composição química do meio caldo vermelho de fenol em g/L: 10,0 de peptona de proteose; 1,0 de extrato de carne; 5,0 de cloreto de sódio (NaCl) e 0,018 de Vermelho de fenol.
3.7.4 Quantificação de fungos
A quantificação de fungos foi realizada através da contagem em placa de Unidade Formadora de Colônias (UFC), pela técnica Pour Plate, em meio Sabouraud Dextrose Agar (Difco, Becton, USA), após 5 dias de incubação à 25 ± 1°C. Após homogeneização, ajustou-se
o pH para 5,6 ± 0,2. Os meios ao serem retirados da autoclave esfriaram à temperatura ambiente e foram armazenados sob refrigeração a 5°C (refrigerador farmacêutico, marca Panasonic, modelo MPR-514).
Composição química do meio Sabouraud Dextrose Agar em g/L: 5,0 de hidrolisado péptico de tecido animal; 5,0 de hidrolisado pancreático de caseína; 40,0 de dextrose e 15,0 de agar.
3.7.5 Quantificação de bactérias precipitantes do ferro
As bactérias precipitantes do ferro foram quantificadas empregando a técnica Pour Plate, utilizando-se um meio, contendo citrato férrico amoniacal (Videla, 2002), após 15 dias de incubação, à 35 ± 1 ºC. Após homogeneização, ajustou-se o pH para 6,6 ± 0,1. Os meios ao serem retirados da autoclave foram armazenados à temperatura ambiente, de modo que ficassem em ambiente escuro.
Composição química do meio para bactérias precipitantes do ferro em g/L: 0,5 de sulfato de amônio ((NH4)2.SO4); 0,5 de nitrato de sódio (NaNO3); 0,5 de potássio fosfato
monobásico anidro (K2HPO4); 0,134 de cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2.2H2O); 0,5 de
sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O); 10,0 de citrato férrico amoniacal e 15,0
de agar.
3.7.6 Quantificação de bactérias anaeróbias totais
As bactérias anaeróbias totais foram quantificadas pela técnica de Número Mais Provável (NMP), em meio fluido tioglicolato de sódio (Himedia, Mumbai, Índia), purgado com N2, após 21 dias de incubação, à 35 ± 1ºC. Após homogeneização completa, ajustou-se o
pH para 7,1 ± 0,2. Esta solução manteve-se aquecida através de uma chapa aquecedora, marca Quimis e modelo Q261-22, e sendo purgada com N2 por 20 minutos ou até alterar a coloração
de rosa para bege. Após serem retirados da autoclave, os tubos foram esfriados e armazenados em temperatura ambiente.
Composição química do meio fluido tioglicolato em g/L: 15,0 de hidrolisado pancreático de caseína; 5,0 de extrato de levedura; 5,5 dextrose (glicose); 2,5 cloreto de sódio (NaCl); 0,5 de L-Cistina; 0,5 de tioglicolato de sódio; 0,001 de resazurina sódio e 0,75 de agar.
3.7.7 Quantificação de bactérias anaeróbias produtoras de ácidos
As bactérias anaeróbias produtoras de ácidos foram quantificadas pela técnica de Número Mais Provável (NMP), em meio caldo vermelho de fenol desidratado (Himedia, Mumbai, Índia), suplementado com 1% de sacarose, após 48h de incubação, à 35 1 °C. Após homogeneização, ajustou-se o pH para 7,4 ± 0,2 e o meio foi purgado com N2, durante
20 minutos.
A composição química do meio caldo vermelho de fenol já descrita no item 3.7.3.
3.7.8 Quantificação de Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)
As bactérias redutoras de sulfato (BRS) foram quantificadas pela técnica de NMP, em meio Postgate - E modificado (Postgate, 1984) purgado com N2, após 21 dias de incubação, à
35 ± 1ºC. Após homogeneização, ajustou-se o pH para 7,8 ± 0,1. A solução foi purgada com N2, durante 20 minutos, modificando a coloração para rosa claro.
Composição química do meio Postgate - E modificado em g/L: 0,5 de potássio fosfato monobásico anidro (KH2PO4); 1,0 de cloreto de amônio (NH4Cl); 1,6 de cloreto de magnésio
hexahidratado (MgCl2.6H2O); 1,0 de sulfato de sódio anidro (Na2SO4); 1,0 de extrato de
levedura; 0,1 de ácido ascórbico (C6H8O6); 1,9 de agar; 0,5 de sulfato ferroso (FeSO4.7H2O);
além de 0,67g de cloreto de cálcio 2H2O (CaCl2.2H2O); 5 ml de lactato de sódio (C3H5NaO3)
e 4 ml de resazurina (0,025%) (C12H6NNaO4).