OF GLIA AND BLOOD : RESUME DE LA PUBLICATION A. Contexte scientifique général

La différenciation cellulaire implique des facteurs clés souvent conservés au cours de l’évolution. Notre équipe s’intéresse à l’un d’entre eux, le facteur de transcription Gcm. Il appartient à une famille de facteurs de transcription caractérisée par un domaine à doigt de Zinc atypique appelé le domaine Gcm.

Gcm est d’abord impliqué dans la différenciation de la glie chez la drosophile. La glie joue de nombreux rôles dans le développement du système nerveux et dans la maintenance des fonctions neurologiques. Les cellules gliales constituent aussi les cellules immunitaires du CNS. Elles proviennent essentiellement de NSCs capables de produire des neurones et de la glie. gcm appartient à ces gènes maîtres qui sont nécessaires et suffisants pour déterminer le destin de la cellule dans laquelle ils sont exprimés. Lorsqu’il est exprimé dans les NSCs, Gcm déclenche la gliogenèse. Chez les embryons mutants pour gcm, seuls des neurones sont produits. Au contraire, l’expression ectopique de Gcm dans les NSCs conduit à une gliogénèse ectopique au détriment des neurones. Gcm agit donc comme un interrupteur moléculaire entre neurones et glie.

Gcm joue également un rôle critique dans l’hématopoïèse embryonnaire. Les précurseurs des hémocytes naissent dans le mésoderme procéphalique. Ils peuvent produire deux types de cellules immunitaires : les plasmatocytes, qui jouent le rôle de macrophage circulant, et les cellules à cristaux, impliquées dans d’autres processus de défense. Gcm est impliqué dans la production des plasmatocytes et la perte de gcm conduit à la production de plasmatocytes non fonctionnels. D’autre part, l’expression ectopique de Gcm dans les cellules à cristaux conduit à leur conversion en plasmatocytes. A l’instar de son rôle dans la différenciation de la glie, Gcm a un rôle de pivot entre la production de plasmatocytes et de cellules à cristaux dans le système immunitaire.

La plupart des facteurs clés impliqués dans la différenciation cellulaire agissent dans plusieurs tissus. La fonction d’un facteur de transcription peut donc varier en fonction du tissu dans lequel il est exprimé. En réalité, la détermination du destin cellulaire dépend d’un réseau de facteurs de transcription qui agissent en synergie avec des cofacteurs, des enzymes et des marques épigénétiques qui modifient leurs activités. Gcm constitue le seul exemple connu à ce

jour dans lequel un gène maître est partagé entre la gliogénèse et l’hématopoïèse. Le principal aspect de ma thèse fut d’identifier d’autres facteurs clés agissant en amont ou en aval de Gcm et impliqués dans le choix entre le destin glial et hémocytaire.

Les cibles de Gcm ont été identifiées par des cribles à l’échelle du génome. Certains gènes sont exprimés à la fois dans la glie et dans les hémocytes comme draper, qui code pour un récepteur de la phagocytose. Cependant, repo, impliqué dans la différenciation terminale de la glie, est exprimé uniquement dans la glie. De la même manière, le gène codant pour le facteur de transcription Srp, de type GATA, est exprimé dans les hémocytes et ne l’est pas dans les cellules gliales. Srp joue un double rôle durant l’hématopoïèse. Avant l’expression de Gcm, Srp est requis pour la spécification des précurseurs hématopoïétiques. Ensuite, en aval de Gcm, Srp peut dimériser avec son cofacteur Ush pour promouvoir la différenciation des plasmatocytes. Comment les cibles de Gcm, Srp et Repo, sont restreintes aux lignages hémocytaires et gliaux?

I.B. Résultats

I.B.1. Caractérisation du potentiel gliogénique et hématopoïétique de Gcm

L’expression ectopique de Gcm peut activer des marqueurs gliaux ou hémocytaires. J’ai d’abord étudié si Gcm est capable d’activer des marqueurs gliaux dans les hémocytes et vice-versa. La surexpression de Gcm dans les précurseurs hématopoïétiques (gcm gain-de-function =

gcm GOF) conduit à l’expression des marqueurs gliaux précoces (Repo) et tardifs (Nazgul) (Fig.

1). Le potentiel gliogénique de Gcm est donc conservé dans les précurseurs hématopoïétiques. De

la même manière, Gcm a été ectopiquement exprimé (gcm GOF) dans la région neurogénique. Les embryons gcm GOF déclenchent une gliogénèse ectopique dans la région neurogénique ventrale tandis que les marqueurs hémocytaires Ush et Srp ne sont activés que dans très peu de cellules restreintes aux régions latérales (Fig. 3). Les territoires d’expression ectopique de Ush/Srp et de Repo sont alors mutuellement exclusifs. Gcm a donc un fort potentiel gliogénique et un potentiel hématopoïétique limité.

I.B.2. Rôle du dosage de Gcm et des facteurs indépendants

Les résultats provenant de la surexpression de Gcm dans les hémocytes suggèrent que la gliogénèse nécessite un niveau d’expression de Gcm plus fort que l’hématopoïèse. Pour vérifier cela, j’ai analysé plusieurs combinaisons d’allèles hypomorphes et nuls de gcm (gcm perte-de-fonction = gcm LOF). Aucune combinaison n’a conduit à l’expression de marqueurs hémocytaires dans la glie présomptive excluant une simple dépendance du dosage de Gcm pour l’établissement du destin glial ou hémocytaire (Fig. S2).

Nous avons suggéré que le potentiel gliogenique de Gcm est contrebalancé par des facteurs indépendants dans le mésoderme procéphalique. J’ai alors étudié les rôles de Srp et du déterminant mésodermal Twi dans ce processus (Fig. 2). 1) La surexpression de gcm dans le mésoderme induit de la gliogénèse ectopique. L’ajout d’une dose de Srp diminue la gliogénèse ectopique (gcm GOF, srp GOF). 2) La réduction d’une dose de Twi (gcm GOF, twi LOF) augmente la gliogénèse ectopique. 3) La surexpression de Twi dans le territoire neurogénique inhibe la gliogénèse (gcm GOF, twi GOF). Le destin hémocytaire ne dépend donc pas uniquement de la quantité absolue de Gcm et est positivement influencé par l’environnement du mésoderme.

I.B.3. Repo contribue à la répression du destin hémocytaire dans la glie.

Les données précédentes suggèrent la présence d’un répresseur du destin hémocytaire dans le CNS. repo est un déterminant majeur du destin glial et constitue une cible de choix. J’ai démontré que repo réprime le destin hémocytaire de trois façons. 1) La surexpression de repo dans le territoire hématopoïétique réprime les marqueurs hémocytaires précoces (Srp) et tardifs (NimC1 = P1) (repo GOF) (Fig. 4). 2) L’expression ectopique de gcm dirigée dans le CNS déclenche une production ectopique de Srp et Ush uniquement dans les animaux mutants pour

repo (gcm GOF repo LOF) (Fig. 3). 3) Dans les animaux mutants pour repo (repo LOF), les marqueurs gliaux ne sont pas activés tandis que certaines cellules gliales présomptives expriment Srp et Ush (Fig. 6). Ces résultats démontrent que Repo est suffisant pour réprimer l’apparition de marqueurs hémocytaires précoces dans la glie.

J’ai ensuite étudié le mode d’action de Repo sur Srp dans les cellules en culture. Des rapporteurs transcriptionnels de srp, mutés ou non pour le site de fixation de Repo (RBS) ont été générés. Bien que Repo réprime srp dans les cellules S2, la mutation du RBS n’a pas levé cette répression (Fig. S4). La répression de srp par Repo semble donc être indirecte, cependant, nous ne pouvons exclure un mode d’action direct à travers des d’autres sites non canoniques.

I.B.4. La perte de fonction de Repo n’induit pas de phagocytes ectopiques.

La perte de repo induit l’expression ectopique des facteurs de transcription hémocytaires dans la glie. Pour étudier si ces hémocytes sont fonctionnels, j’ai analysé le territoire d’expression de Crq, récepteur membranaire de type CD36, qui contribue largement à leur activité de phagocytose des corps apoptotiques. Aucune expression ectopique de Crq n’a été détectée démontrant l’absence de maturité de ces cellules (Fig. S6).

Durant le développement embryonnaire, les cellules gliales associées au cortex jouent le rôle de macrophages dans le CNS. Il était donc intéressant d’étudier le rôle de Repo sur l’activité de phagocytose de ces cellules. De manière surprenante, Repo semble requis pour le nettoyage des corps apoptotiques par la glie car en l’absence de repo, le nombre de contacts entre les protrusions cytoplasmiques des CBGs et les corps apoptotiques diminue drastiquement. En outre, ces cellules n’expriment plus les récepteurs de la phagocytose Draper et SIMU. Bien qu’en l’absence de Repo des marqueurs hémocytaires précoces apparaissent dans la glie, Repo semble donc nécessaire à la maturation des cellules gliales et en particulier à leur activité macrophagique (Fig. 5).

I.B.5. Repo agit comme le gardien de l’identité gliale.

Suivant la perte de repo, seule une fraction de la glie présomptive adopte le destin hémocytaire. Ce phénotype soulève la question de la destinée des autres cellules gliales présomptives. Nous savons que les gènes pan-gliaux repo et tramtrack (ttk) agissent en synergie pour réprimer le destin neuronal lorsqu’ils sont exprimés ectopiquement dans le CNS. L’hypothèse d’une différenciation neuronale a donc été émise. Dans les embryons repo LOF, j’ai alors démontré que le destin hémocytaire est en compétition avec le destin neuronal (Fig. 7). 1)

Dans les embryons repo mutants (repo LOF), une autre fraction de la glie présomptive se différencie en neurones. 2) La perte supplémentaire de elav (repo/elav LOF), un gène critique pour la différenciation des neurones, augmente la proportion d’hémocytes ectopiques dans la glie présomptive. 3) Dans les embryons repo et ttk double mutants (repo/ttk LOF), la proportion des neurones ectopiques augmente tandis que celle des hémocytes ectopiques diminue. Repo est donc nécessaire pour réprimer à la fois le destin hémocytaire et le destin neuronal qui sont mutuellement exclusifs.

I.C. Conclusion

En conclusion, Gcm constitue un modèle unique dans lequel un gène maître est requis à la fois pour la différenciation de la glie et des hémocytes. J’ai démontré que la cible directe de Gcm dans la glie, Repo, joue une large action pour réprimer le potentiel hématopoïétique de Gcm, le potentiel neuronal de la NSC et consolider le destin glial. J’ai donc proposé que Repo agisse comme le gardien du destin glial. Cette étude apporte un point de vue novateur sur le rôle crucial des gènes qui agissent directement en aval du gène maître déclenchant le processus de différenciation. Ce travail amène aussi de nouvelles perspectives concernant les mécanismes gouvernant la fonction immunitaire de la glie, comme par exemple, lors de la réparation du CNS suivant une blessure. Il serait intéressant d’étudier si Repo peut participer à ce processus en régulant positivement ou négativement la production de phagocytes.

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