Germination des grains de pollen

Par ailleurs, un impact éventuel des mutations sur la capacité de germination « in vivo », sur des pistils, a été examiné.

La germination des grains de pollen mutants sur les pistils mutants a été examinée par coloration des tubes polliniques au bleu d’aniline. Des tubes polliniques d’apparence normale ont pu être observés chez tous les mutants (Annexes 7 et 8). Une production de graines similaire à celle des plantes sauvages n’est donc pas étonnante.

L’ensemble des observations indique que les fonctions assurant la fertilité mâle, incluant la déhiscence des anthères, la libération de pollen mature ayant la capacité de germer, sont donc conservées chez les lignées ayant une expression modifiée des CYP94s.

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6.3 Conclusion

Nous avons abordé de nouveaux aspects du métabolisme des JAs dans les fleurs d’Arabidopsis thaliana. Ces travaux ont permis de mettre en évidence pour la première fois les niveaux relatifs de JA-Ile et de ses formes oxydées dans les fleurs d’Arabidopsis thaliana. Les données de RT-qPCR et les lignées GUS montrent que les 6 CYP94s sont exprimés selon un pattern spécifique dans les fleurs, suggérant des fonctions particulières pour chaque P450.

CYP94C1 est exprimé dans les anthères des étamines et plus fortement après ouverture de la

fleur. Les analyses métaboliques de jasmonates ont mis en évidence que les mutants ayant une expression réduite de CYP94C1 (mutants knock-out et RNAi) ont des niveaux de 12COOH-JA-Ile extrêmement faibles, démontrant le rôle majeur de CYP94C1 dans la carboxylation de l’hormone JA-Ile au sein de la fleur. Puisque CYP94C1 est exprimé dans les anthères et produit la majorité des quantités détectables de 12COOH-JA-Ile, il est fort probable que la synthèse de 12COOH-JA-Ile ait lieu essentiellement dans ces pièces florales. La fleur étant un organe très complexe, une organisation spatiale très fine de la voie métabolique est en place. La perte d’expression de CYP94C1 ou sa surexpression n’affectent que peu les niveaux de l’hormone JA-Ile. Comme déjà observé dans les feuilles stressées du mutant sur-exprimant

CYP94C1, la signalisation JA-Ile est affaiblie dans les fleurs, malgré des niveaux de JA-Ile

peu affectés. Chez le mutant OEC1, en dépit d’une carboxylation excessive de l’hormone et d’une diminution de l’expression de gènes de biosynthèse (AOC1) et de signalisation des jasmonates (facteurs de transcription MYB21 et MYB24), les niveaux de l’hormone JA-Ile sont maintenus à une quantité proche de celle des plantes de type sauvage dans le premier lot de plantes analysé et le mutant est fertile. Des mécanismes compensatoires au niveau métabolique pour contrôler le turnover de JA-Ile (catabolisme par IAR3 et ILL6), mais également au niveau transcriptionnel de la signalisation (répresseurs JAZs) pourraient contribuer à assurer la fertilité du mutant sur-exprimant CYP94C1.

192

6.4 Discussion

Chez Arabidopsis thaliana, nous avons observé des niveaux de JA plus élevés que ceux de JA-Ile dans les fleurs ouvertes, contrairement aux fleurs matures de tomate où les quantités de JA-Ile sont plus élevées que celles de JA (Hause et al., 2000). Les profils de jasmonates semblent donc espèce-spécifiques.

Nous avons observé que CYP94C1 joue un rôle prépondérant pour l’oxydation de JA-Ile dans les fleurs. CYP94C1 est exprimé majoritairement dans l’anthère des étamines et

CYP94B1 dans le filet des étamines et dans les pétales. Il y a donc une spécificité dans le

pattern d’expression des CYP94s dans les fleurs. Une spécificité d’expression de gènes d’une même famille dans la fleur d’Arabidopsis thaliana a également été observée pour les gènes

AOCs de biosynthèse de JA et pour les gènes GA3ox de biosynthèse de GA (Hu et al., 2008;

Stenzel et al., 2012).

Le rôle de CYP94B3 dans la fleur reste à découvrir. L’analyse de son profil transcriptionnel par RT-qPCR dans des fleurs disséquées a montré que ce gène est exprimé au maximum dans les pétales des fleurs totalement ouvertes. La localisation et les quantités de JA-Ile dans chaque pièce florale demandent à être élucidées pour mieux comprendre le rôle de l’hormone. D’après les résultats concernant CYP94C1, la carboxylation de JA-Ile a très probablement lieu dans les anthères ce qui suggère que JA-Ile est accumulé dans cette structure. L’étamine est une pièce florale complexe, au sein de laquelle des gènes de biosynthèse, de signalisation et d’inactivation de JA-Ile sont exprimés. Certains gènes de biosynthèse ont des patterns d’expression restreints au sein de l’étamine, par exemple DAD1 est exprimé dans le filet, AOS est exprimé dans les faisceaux vasculaires de l’anthère et AOC4 dans la partie basale de l’anthère (Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; Stenzel et al., 2012). L’activité tissulaire spécifique de ces gènes de biosynthèse suggère qu’il pourrait y avoir un transport des précurseurs successifs des jasmonates dans le sporophyte mâle, du filet vers l’anthère, et que le contrôle des niveaux de JA-Ile pourrait être assuré en aval par CYP94C1, qui est exprimé dans toute l’anthère.

Les mutants que nous avons étudiés sont fertiles. La fonction de l’oxydation de JA-Ile après ouverture de la fleur dans les anthères déhiscentes reste à définir. L’oxydation de JA-Ile pourrait être nécessaire pour qu’une signalisation mène au dessèchement des étamines une fois le pollen mature libéré. Chez les mutants KO, le blocage de la voie oxydative n’élève pas

193 significativement les niveaux de JA-Ile, montrant que d’autres mécanismes de gestion hormonale existent ou se mettent en place chez ces lignées.

CYP94B1 catalyse probablement l’oxydation d’un autre métabolite que Ile et JA-Phe dans les fleurs, peut-être l’oxydation d’un autre conjugué JA-acide aminé. Chez Pisum

sativum, le conjugué JA-Trp est 58 fois plus abondant que JA-Ile dans les fleurs, suggérant

que JA-Trp pourrait également jouer un rôle dans cet organe (Staswick, 2009a). Le conjugué JA-Tyr est par ailleurs accumulé dans les fleurs de Vicia faba (Kramell et al., 2005). Il serait intéressant de connaître les quantités de tous les conjugués JA-acide aminés dans les fleurs d’Arabidopsis thaliana pour déterminer lesquels pourraient être impliqués dans la signalisation des jasmonates contrôlant le développement floral chez cette espèce. Des conjugués JA-acide aminés pourraient également être des formes de stockage de JA.

COI1 est nécessaire au développement floral (Xie et al., 1998). Les oxydations de JA-Ile dans les fleurs suggèrent que les niveaux de ce conjugué doivent être contrôlés. Cependant, il reste à démontrer si JA-Ile est la seule hormone de type jasmonate active dans les fleurs car le mutant jar1 est fertile. JA-Phe est formé seulement partiellement par JAR1 dans les feuilles, indiquant l’existence d’autres enzymes de conjugaison. On peut imaginer qu’un autre conjugué JA-acide aminé, produit par une autre enzyme que JAR1, pourrait avoir la capacité à lier COI1 et promouvoir des processus de développement floral.

195

RESULTATS partie 3 :

Diversité de l’oxydation de conjugués

JA-acides aminés : exemple de l’étude

197

7 IDENTIFICATION DE NOUVEAUX

JASMONATES OXYDES : CYP94B3 ET CYP94C1

CATALYSENT LA CARBOXYLATION DE

JA-PHE ET DE JA-ILE VIA DES INTERMEDIAIRES

ALDEHYDES