Si les Gallionellaceae sont connues depuis aussi longtemps, c’est parce que certaines d’entre elles forment des structures extracellulaires très particulières. En effet certaines d’entre elles produisent des exopolysaccharides permettant d’aggréger le fer (III), insoluble dans l’eau, en longs et fins filaments pouvant mesurer plusieurs dizaines de micromètres (46, 54, 61) (Figure 8a). La rotation sur elles-mêmes de ces bactéries induit une torsion des filaments, leur donnant ainsi une forme de torsade caractéristique (Figure 8b) (61). L’accumulation de ces torsades peut former des biofilms (Figure 8c) et jusqu’à de véritables tapis bactériens longs et larges de plusieurs mètres, avec une épaisseur pouvant aller jusqu’à 20 cm (Figure 8d). La capacité à former ces torsades n’a été observé que chez les genres Gallionella et Ferriphaselus (46, 55, 62). Elle semble absente du genre
Sideroxydans. Du plus, il faut noter que la production de structures torsadées existe aussi chez le genre Mariprofundus qui appartient à la classe des Zetaproteobacteria (63). Ce genre regroupe des bactéries oxydant le fer mais uniquement dans les environnements marins tels que les sources hydrothermales.
Figure 8 : Observation des structures extracellulaires produites par certaines Gallionellaceae, de l’échelle de
la cellule jusqu’à l’échelle du tapis microbien. A | Microscopie électronique d’une cellule de Gallionella ferruginea avec ses filaments (x25 000), d’après Vatter 1956 (62). B | Microscopie électronique d’un biofilm
contenant des FeOB productrice de torsades, prise par Luc Burté. C | Tête de puit du forage PZ26 sur le site de Ploemeur/Guidel (Bretagne, France). Photo prise par Julien Farasin en mai 2016.
23
Les Gallionellaceae sont des organismes aérobies (54). Mais l’oxydation abiotique du fer Fe(II) se réalisant spontanément en présence d’une concentration élevée de dioxygène, les Gallionellaceae sont cantonnées aux environnements microaérobies (<1,5mg/L), où la concentration en oxygène est suffisamment faible pour une oxydation abiotique plus lente du Fe(II) (21, 55). Elles sont donc spécialistes des zones d’interfaces entre un compartiment contenant de l’oxygène et un compartiment anoxique riche en Fe(II) (8), telles que des zones de résurgence d’eau souterraine à l’air libre. La présence de biofilms de Gallionellaceae représente ainsi un véritable marqueur facilement identifiable des zones d’interface entre des milieux oxiques riches en oxygène comme l’atmosphère et des milieux anoxiques riches en fer comme les eaux souterraines profondes. Nous avons vu dans la partie décrivant le massif armoricain, que l’oxygène est un élément relativement peu présent dans la zone fracturée. Pourtant ces dernières années, plusieurs articles scientifiques ont montré la présence de Gallionellaceae en abondance dans les milieux souterrains profonds (19, 20), indiquant ainsi la possibilité d’existence de zones d’interface entre une eau jeune riche en oxygène et une eau ancienne anoxique mais riche en Fe(II), en profondeur dans les milieux souterrains.
24
ETUDE DES BACTERIES DANS LES MILIEUX
SOUTERRAINS
L’isolement des microorganismes, par une mise en culture, a longtemps été la seule méthode pour réaliser la description physiologique de ceux-ci et ainsi mieux comprendre l’écologie des différentes espèces. Au début du siècle dernier il était d’ailleurs considéré comme impossible de proposer de nouvelles espèces bactériennes sans avoir ces bactéries en culture pure (64). Nous n’avions ainsi comme vision de la diversité microbienne que celle cultivable. Bien que cette démarche soit toujours efficace et appliquée dans de nombreux domaines de recherche, à partir des années 70-80, cette approche est devenue de moins en moins systématique en écologie microbienne. En effet, l’approche culturale classique ne fonctionne pas pour une proportion très importante des micro-organismes présents dans l’environnement (65). De nos jours il est ainsi reconnu que les microorganismes cultivables ne représentent que 0,1 à 1% de la diversité totale quel que soit le milieu échantillonné. L’avènement de techniques basées sur l’analyse de l’ADN des organismes a révolutionné notre connaissance de la diversité du monde microbien. Parmi ces méthode, la PCR (Polymerase Chain Reaction) proposée en 1983 par Mullis (66) occupe une place centrale. En effet elle permet de copier de nombreuses fois une partie spécifique d’un génome. Dans une approche culturale classique, la PCR peut être utilisée pour révéler la possession d’un gène dans le génome d’une bactérie en culture pure par exemple. Mais elle peut aussi nous permettre d’accéder à la diversité des microorganismes sans avoir à passer par des étapes d’isolements et de cultures. Elle s’est ainsi imposée comme une technique moléculaire de référence dans l’analyse fonctionnelle et taxonomique de tous les microorganismes. Dans les milieux où la diversité microbienne est très peu connue, comme les milieux souterrains, et où les conditions de vie de ces microorganismes sont difficilement reproductibles en laboratoire (e.g. conditions microaérobies), il est indispensable de trouver une autre approche que l’isolement microbien pour mieux appréhender l’écologie de ceux-ci. Cette approche peut être la métagénomique, de « méta » signifiant « au-delà, après » pour faire référence à un niveau supérieur, et génomique pour désigner l’étude des génomes. Ce terme a été proposé pour la première fois en 1998 par Handelsman (67) et désigne ainsi l’étude d’une communauté de microorganismes présents au sein d’un même
25
échantillon environnemental, à partir de l’ADN total extrait de l’échantillon. La métagénomique repose ainsi sur le séquençage de l’ADN contenu dans un échantillon. Cette approche permet non seulement d’avoir accès à la diversité et l’abondance relative des organismes présents, mais aussi aux séquences des gènes codant pour les protéines impliquées dans les différentes voies métaboliques de ces microorganismes. De plus, à partir de données métagénomiques il est possible de reconstruire les génomes des procaryotes indigènes qui étaient présents dans l’échantillon (68). Une autre approche similaire est le méta-barcoding (67). Bien que le méta-barcoding soit régulièrement présenté sous le terme de métagénomique dans la littérature, nous considérons dans ce manuscrit qu’il s’agit d’une approche différente. En effet, par cette approche seule une séquence spécifique de chaque génome est séquencée, comme par exemple une partie du gène de l’ARN ribosomique 16S (pour les bactéries et les archées) après amplification PCR. Cela permet ainsi de connaître la diversité et d’estimer l’abondance relative des bactéries et des archées présentes dans un écosystème.
En 1977 est proposée la première technique de séquençage, la méthode Sanger (69). Bien que cela représente une avancée majeure, cette méthode demandait beaucoup de temps, d’argent et surtout dépendait de l’appréciation visuelle de l’expérimentateur, ce qui était source de beaucoup d’erreurs. Dans les années suivantes, les techniques se sont automatisées et ont été améliorées. Il faut de moins en moins de temps pour séquencer de plus en plus de génomes et pour un coût de moins en moins élevé (70). Cela a permis l’essor de la métagénomique lors de ces 15 dernières années. Pour réaliser le séquençage, la méthode la plus utilisée à l’heure actuelle est la méthode développée par la société Illumina (71). Celle-ci nécessite la fragmentation de l’ADN extrait en petites molécules de 150 à 300 nucléotides. Après séquençage il est possible de se baser sur la séquence de ces fragments, les reads, pour reconstruire de plus grandes séquences, les contigs (72). Ces contigs peuvent ensuite être regroupés en MAGs (Metagenome-Assembled Genomes), correspondant aux génomes d’une population de cellules bactériennes suffisamment proches. C’est grâce à cela qu’ont été assemblés plusieurs milliers de génomes de bactéries inconnues ces dernières années (51–53, 57). Les premières méthodes de reconstruction des génomes ayant été proposées se basaient principalement sur deux mesures (68, 73), (i) la fréquence de motifs de nucléotides de différentes tailles (di, tri, tetranucléotides, etc.) dans les contigs et (ii) l’abondance relative des contigs dans les métagénomes, c’est-à-dire l’estimation du nombre de reads du métagénome correspondant à la séquence de chaque contig. Ces méthodes ont été rapidement intégrées dans d’autres outils en plus d’autres critères de décision permettant aux utilisateurs de
26
pouvoir affiner les résultats obtenus. Trois de ces outils ont été testés lors de cette thèse : GBtools (74), MMGenome (75) et Anvi’o (76). Tous ces outils intègrent ainsi évidemment l’étude de la fréquence en nucléotides et le recouvrement en reads des contigs, et l’affiliation taxonomique des séquences codantes dans la séquence des contigs. Anvi’o permet en plus de rechercher, parmi les contigs, des gènes connus pour être présents en une seule copie dans toutes les bactéries et archées. Cela permet d’estimer le taux de complétion de chaque MAG et d’éviter les redondances. GBTools et MMGenome fonctionnent tous les deux avec le langage R et permettent une représentation graphique du regroupement des contigs pour faciliter l’interprétation des résultats. Si avec GBTools il est seulement possible d’identifier visuellement les différents MAGs proposés dans les nuages de points, MMGenome permet en plus de mettre en lumière clairement les liens entre les contigs d’un même MAG sous forme de réseau. Cela représente la principale différence entre GBTools et MMGenome. Pourtant ce mode de présentation reste limité et ne permet pas d’ajouter ou de supprimer manuellement les contigs afin d’améliorer l’assemblage des MAG. En revanche le logiciel Anvi’o apporte une combinaison unique de méthodes de regroupement automatisées et de méthodes nécessitant la supervision d’un opérateur humain pour produire les assemblages de génomes les plus complets et avec la redondance la plus faible. Ceci a été un critère majeur justifiant le choix de cet outil lors de cette thèse.
27
QUESTIONNEMENTS ET DEMARCHE
EXPERIMENTALE
L’objectif principal de cette thèse était de caractériser la diversité et les fonctions des bactéries oxydantes du fer de la famille des Gallionellaceae, et de déterminer leurs liens avec les conditions physico-chimiques propres aux aquifères de socle fracturés riche en fer du massif armoricain. Les travaux menés ont porté sur les milieux naturels et sur certaines perturbations anthropiques. Cet objectif s’inscrit dans une démarche pluridisciplinaire plus large qui vise à mieux contraindre le fonctionnement biogéochimique des zones d’interfaces au sein des milieux souterrains hétérogènes riche en fer.
Cet objectif a été traité en suivant deux axes majeurs :
Axe 1 : Caractériser la diversité et les fonctions des Gallionellaceae face aux fluctuations spatiales et temporelles des conditions physico-chimiques des zones d’interface au sein des aquifères de socle fracturés riche en fer.
Par cet axe, nous avons cherché à savoir :
- Quelle diversité des Gallionellaceae peut être observée au sein d’un même aquifère ? - Quelle est la variation de l’abondance des Gallionellaceae en fonction des zones de mélange
dans l’aquifère ?
- Quelles sont les capacités métaboliques permettant aux Gallionellaceae de se maintenir, de croitre et d’influencer leur milieu de vie ?
Les chapitres 1 et 2 portent sur des études menées dans le cadre de l’axe 1.
Axe 2 : Déterminer l’impact des perturbations d’origine anthropique sur la réactivité biogéochimique des bactéries oxydantes de fer dans ces aquifères de socle fracturé.
28
Nous nous sommes focalisés sur deux causes de perturbations anthropiques dans ces milieux : une pollution du milieu et la création et l’exploitation d’un système de captage de l’eau souterraine. Les questions posées étaient ainsi :
- Quelle est la réponse des communautés bactériennes face à une modification ponctuelle de la chimie des eaux souterraines, dans le cas d’une pollution ?
- Quelle est la réponse des communautés bactériennes en cas de modification de la circulation des eaux souterraines, comme lors de la création et de l’exploitation d’un système de captage de l’eau souterraine ?
Les chapitres 3 et 4 portent sur des études menées dans le cadre de ce deuxième axe.
Pour répondre à ces deux axes et quelle que soit l’étude menée, la démarche expérimentale privilégiée a été basée sur un couplage d’analyses métagénomiques et d’analyses hydrogéochimiques dans un contexte hydrogéologique bien contraint. Toutes les études menées sont le fruit de collaboration principalement avec plusieurs doctorants (maintenant docteurs) du laboratoire Géosciences Rennes ayant réalisés les analyses hydrogéochimiques : Olivier Bochet (Chapitres 1 et 2), Eliot Chatton (Chapitre 3) et Luc Burté (Chapitre 4). Je me suis ainsi concentrée sur l’acquisition des données, leurs traitements et l’interprétation des résultats des analyses métagénomiques.