Génération et importance des ROS

L’oxygène étant le substrat dans la formation de ROS, les systèmes de production de ROS apparaissent comme un mécanisme potentiellement important pour la détection de l’oxygène et l’aérotaxie. De plus, comme mentionné dans l’introduction, il apparaît de plus en plus évident que

DISCUSSION

116 les ROS sont de véritables seconds messagers dans la régulation de nombreux processus biologiques, dont la migration dirigée et l’invasion (Hurd et al., 2012).

1. L’inhibition globale des ROS affecte la migration sous confinement

L’utilisation d’antioxydants (NAC, GSH), qui permettent d’augmenter la vitesse de dégradation des ROS et de réversion de modifications post-traductionnellles dépendant des ROS, inhibe la migration des cellules sous confinement, pointant un rôle important des ROS dans l’aérotaxie. Les concentrations en antioxydants utilisées sont élevées (10 mM) mais n’affectent pas la migration des MCF10A lorsqu’elles sont ensemencées à faible confluence ou lors d’un test de comblement de blessure. En alternative à l’utilisation de ces fortes concentrations d’antioxydants, nous pourrions surexprimer simultanément dans nos cellules deux types d’enzymes: la superoxyde dismutase (SOD) et la catalase (CAT), afin de détoxifier les ROS en transformant respectivement l’anion superoxyde en H2O2 et l’H2O2 en H2O.

2. Génération d’un gradient d’H2O2

A l’aide de la sonde HyPer capable de mesurer en temps réel et de façon réversible l’H2O2

intracellulaire, et de la sonde chimique cumulative fluorescente CellROX, nous avons montré qu’un gradient d’H2O2 se forme rapidement sous confinement à l’échelle de l’amas de cellules. En effet, les cellules situées dans les régions plus riches en oxygène produisent davantage d’H2O2 que les cellules hypoxiques du centre. Par ailleurs, ce gradient d’H2O2 est inhibé par la présence d’antioxydants et semble se superposer au gradient d’oxygène. Des expériences préliminaires avec la sonde HyPer semblent d’ailleurs indiquer que l’inhibition de la respiration mitochondriale (par l’Antimycin A et l’Oligomycine D) empêche la formation de ce gradient d’H2O2. Ces données supposent que le gradient d’H2O2 est directement lié au gradient d’oxygène.

D’autre part, comme mentionné dans l’introduction, l’activation d’EGFR provoque une production d’H2O2 par les NOXs (Mishina et al., 2013; Paulsen et al., 2012). Seulement, malgré l’absence d’EGF et donc d’activation d’EGFR sous confinement (dans les MCF10A/12A et HMECt), les cellules génèrent quand même un gradient d’H2O2 (Figure 33). Ce résultat est particulièrement important car il démontre que le gradient d’H2O2 n’est pas dû au gradient d’activation d’EGFR.

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Représentation en fausse couleurs du ratio HyPer (488/405) des cellules MCF10A-Hyper avant confinement puis à 1h et 6h de confinement, dans une région de l’amas de cellules. Barre d’échelle : 80 μm. Le graphique de droite est une représentation du profil du ratio HyPer selon l’axe des x (en μm).

De façon intéressante, ce type de gradient est retrouvé in vivo durant le processus de cicatrisation chez le zebrafish (Niethammer et al., 2009). Au niveau de la blessure, la production d’H2O2 par la NADPH oxydase DUOX des cellules épithéliales génère en 10 min un important gradient d’H2O2

(0,5-50μM) sur une distance d’environ 200μm. Ce gradient est notamment à l’origine de la migration dirigée des neutrophiles et de leur recrutement au site de blessure. Dans ce processus, l’oxydation de la tyrosine kinase Lyn contrôle la migration dirigée des neutrophiles (Yoo et al., 2011). D’autres études ont montré un rôle chimiotactique de l’H2O2 pour des neutrophiles et des cellules musculaires lisses vasculaires (Klyubin et al., 1996; Li et al., 2000).

Dans ce contexte, comment le gradient d’H2O2 observé sous confinement est-il généré ? Avec nos outils, il est impossible de conclure sur la nature extracellulaire du gradient, comme observé in vivo par Niethammer et ses collègues. Néanmoins, différents mécanismes pourraient être impliqués. Dans un premier temps, les cellules du front extérieur de l’amas peuvent produire de l’H2O2 dans le milieu extracellulaire, qui va par diffusion générer un gradient extracellulaire d’H2O2. De façon différente, la production d’H2O2 pourrait être proportionnelle à la quantité d’oxygène, et ainsi générer un gradient d’H2O2 sous confinement, qui se superpose au gradient d’oxygène. N’ayant pas identifié la ou les sources d’H2O2 impliquées dans la formation du gradient, il est difficile de privilégier un mécanisme.

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3. Source de production d’H2O2

L’utilisation des antioxydants NAC et GSH permettent de détoxifier les ROS produits dans toute la cellule de façon non spécifique. Les ROS produits à la mitochondrie représentant la majeur part des ROS totaux, nous avons analysé l’effet d’un antioxydant spécifique de la mitochondrie, le mitotempo. Celui-ci se localise spécifiquement à la mitochondrie et détoxifie les ROS (H2O2, anion superoxyde) (Rocco-Machado et al., 2015). Le traitement des cellules avec le mitotempo n’a aucun effet sur la motilité et la directionnalité des cellules sous confinement, suggérant que les ROS mitochondriaux ne sont pas impliqués dans l’aérotaxie, ce que les expériences menées avec les cellules rho0 laissaient déjà suspecter.

Une autre façon de diminuer le niveau d’H2O2 est d’inhiber plus spécifiquement les enzymes qui le produisent. Il est important de noter que l’H2O2, bien que relativement stable dans le milieu extérieur, semble agir très localement dans la cellule, sur des distances proches de 1 μm (Mishina et al., 2010). Ainsi, la régulation redox du récepteur membranaire EGFR résulterait d’une production locale d’H2O2. Les enzymes membranaires NADPH oxydases (NOXs) constituent donc des candidats évidents. Tout d’abord, nous avons cherché à inhiber ces NOXs par une approche pharmacologique, à l’aide de l’inhibiteur bien connu et non spécifique, le Diphenyleneiodonium (DPI) (Altenhöfer et al., 2014). Le DPI à 1μM inhibe considérablement la migration dirigée sous confinement, au même titre que le NAC et le GSH. Seulement, le DPI a un effet indésirable important car il inhibe la consommation d’oxygène mitochondriale, probablement via l’inhibition du complexe 1 (Bulua et al., 2011). Ainsi, aux concentrations de DPI inhibant la migration, nous avons montré que HIF-1α n’est pas stabilisé sous confinement. Le gradient d’oxygène est donc inhibé par le DPI et l’effet de celui-ci dans l’aérotaxie ne peut donc être interpréter. Par conséquent, nous avons cherché à invalider spécifiquement les NOXs pouvant être impliqués dans la production d’H2O2 sous-membranaire, et potentiellement responsables de l’aérotaxie dépendante de l’oxydation d’EGFR. L’analyse de l’expression de NOXs dans les MCF10A, MCF12A et HMECt révèle que NOX5 et DUOX1 sont essentiellement exprimés dans les cellules épithéliales mammaires (Figure 34). Nous avons donc invalidé NOX5 et DUOX1 par CRISPR Cas9 dans les MCF10A. Cependant, chacune des lignées invalidées pour NOX5 ou DUOX1 ne montre aucune défaillance dans la migration dirigée sous confinement. Ces résultats suggèrent que les NADPH oxydases NOX5 et DUOX1 ne sont pas impliquées dans l’aérotaxie des MCF10A. Il serait néanmoins nécessaire de réaliser une invalidation de ces deux protéines dans une même lignée afin d’exclure des fonctions redondantes. De plus, l’étude des NOXs restent très difficile en raison de l’absence d’inhibiteur spécifique (Altenhöfer et al., 2014), et de l’absence d’anticorps efficaces, nous empêchant d’exclure totalement l’expression de transcrits alternatifs dans les lignées NOX5 -/- et DUOXA-/- générées par CRISPR/Cas9.

DISCUSSION

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Niveaux d’ARN messagers relatifs à l’actine des 7 NADPH oxydases dans les cellules MCF10A, MCF12A et HMECt.

D’autres enzymes pourraient être impliquées dans l’oxydation d’EGFR, comme les lipoxygénases ou les protéines MICAL. En effet, une étude propose que la 15-Lipoxygénase (15-Lox1) contrôle la migration de cellules musculaires lisses vasculaires à travers sa capacité à réguler EGFR de façon ROS dépendante (Singh et al., 2011). D’autre part, l’équipe de Michael F.Olson soumet l’idée que les protéines monooxygénases MICAL, sont impliquées dans la polarisation et la migration dirigée, via une production d’H2O2 et l’oxydation de la cofiline au niveau des protrusions (Cameron et al., 2015; Rudzka et al., 2015).

4. Hypoxie et production de ROS

Il est généralement accepté que les niveaux de ROS sont modulés en conditions hypoxiques. Cependant, la direction dans laquelle ces changements ont lieu est toujours débattue. Par exemple, des résultats contradictoires concernent la NADPH oxydase NOX4. En effet, alors que certains montrent que la production de ROS par NOX4 est proportionnelle à la concentration en oxygène, d’autres démontrent que l’hypoxie active la production de ROS par NOX4 (Nisimoto et al., 2014; Rathore et al., 2008). Cependant, une étude récente a montré, dans plusieurs lignées cellulaires en culture, que la production d’H2O2 peri-membranaire par les NADPH oxydases est considérablement plus importante à une pO2 de 18% qu’à une pO2 de 5% (Maddalena et al., 2017). D’autre part et de manière contre-intuitive, il paraît aujourd’hui clair que l’hypoxie induit une activation de ROS mitochondriaux (Hernansanz-Agustín et al., 2017; Smith et al., 2017).

Dans notre modèle, la production d’H2O2 intracellulaire est plus importante pour les cellules situées à l’extérieur de l’amas, où l’oxygène est présent en plus grande quantité. La faible production d’H2O2 au centre hypoxique peut être expliquée par le fait que cette région soit sévèrement hypoxique, empêchant une production de ROS. Ces données confirment des résultats Figure 34 : Expressions des NADPH oxydases

DISCUSSION

120 obtenus dans un modèle in vitro visant à mimer le microenvironnement tumoral, dans lequel les niveaux de ROS sont très faibles dans les régions hypoxiques et augmentent au fur et mesure que l’oxygène devient disponible (Ayuso et al., 2016).

Pour résumer, la production de ROS sous confinement pourrait être fortement inhibée au centre de l’amas par une anoxie sévère, tandis que les cellules ayant accès à l’oxygène peuvent générer des ROS responsables de la régulation redox de protéines impliquées dans la migration dirigée sous confinement.