Généralités sur la régénération - Élucidation des bases cellulaires et moléculaires de la forma

V) INTRODUCTION

1. Généralités sur la régénération

Le terme « régénération » recouvre un grand nombre de phénomènes physiologiques, allant de la reconstitution homéostatique de tissus tels que le sang et la peau, en passant par la reconstruction du muscle squelettique chez les vertébrés pour finir par l’établissement de-novo d’un organisme entier chez le ver planaire. Pourtant, d’un point de vue mécanistique il s’agit de phénomènes différents. Chez l’animal, on distingue deux grands types de régénération ; la régénération sans prolifération et avec prolifération. Il est donc important de définir ces termes, pour introduire la régénération des membres chez les vertébrés, objet de mon travail de thèse.

Régénération sans prolifération

1.1.1. Régénération morphallactique

La régénération morphallactique se rapporte au type de régénération qui se déroule sans prolifération faisant intervenir des tissus existants qui se réorganisent pour former les nouvelles structures. La régénération morphallactique trouve son exemple au sein du groupe des Cnidaires, notamment chez les polypes de l’espèce Hydra. Cette capacité a été décrite par Tremblay en 1744 (1992)(Galliot, 2012). Les polypes possèdent une symétrie radiale et se présentent sous forme cylindrique, avec à une extrémité des tentacules et une bouche ; la tête, et à l’autre extrémité un disque basal et un pédoncule ; le pied. Ils sont composés de deux

20 feuillets ectodermique et endodermique dont les lignages sont déterminés durant l’embryogénèse et ne sont pas interchangeables et d’une matrice interstitielle ; la mésoglée. Les feuillets contiennent des cellules en constante division et le polype maintient sa taille en bourgeonnant (reproduction asexuée).

Lors du processus de régénération, après amputation de la tête ou du pied du polype aucun évènement de prolifération cellulaire n’est détecté au niveau de la blessure (Galliot, 2012). Les mécanismes mis en place au cours de ce processus sont semblables à ceux de la morphogenèse normale, notamment en termes de profil d’expression de certains gènes, d’activation de voies de signalisation, et d’interactions intercellulaires. Pour autant, la régénération et la morphogénèse sont des processus qui se distinguent par leur origine et les mécanismes associés.

Régénération avec prolifération

1.2.1. Régénération compensatoire

La régénération compensatoire, différente de la régénération morphallactique de par les mécanismes impliqués, ne restaure pas le tissu perdu. En effet, ce sont les parties non blessées du tissu qui vont, par croissance, compenser leur perte. Un exemple de ce type de régénération est retrouvé chez les mammifères au niveau du foie. Si une résection des deux lobes est pratiquée, le troisième va croitre jusqu’à restaurer la masse d’origine du tissue (Michalopoulos, 2010).

21 1.2.2. Régénération épimorphique

La régénération épimorphique, qui m’a intéressée tout au long de ma thèse, est la capacité de certaines espèces, à régénérer leurs membres ou appendices. Le membre régénéré est, en termes de masse, structure et fonction, identique au membre amputé. Ce processus se déroule en trois phases plus ou moins rapides selon les espèces et leur stade de développement. La première étape consiste à la formation d’un épithélium qui recouvre la blessure et qui précède la formation du blastème de régénération essentiel à la repousse du membre ; il s’agit de la formation de « l’apical epithelial cap » (AEC) (figure 1 (3)). Cette formation de l’AEC est précédée par une étape de cicatrisation (figure 1, (2)). La formation de l’AEC est suivie par la mise en place du blastème, amas cellulaire hétérogène (voir figure 1, (4)). La dernière étape consiste en la repousse du membre et à son patterning proximodistal, qui permet au nouveau membre d’obtenir une fonctionnalité, une masse et une structure identiques à l’ancien (voir figure 1, (5)).

Figure 1. Les étapes du processus de régénération épimorphique chez les vertébrés

Après l’amputation ou l’excision du membre (1), se forme un épithélium de blessure pendant la cicatrisation (2), puis la formation de l’AEC (3), en bleu. Celle-ci permet la mise en place du blastème (4), en vert, constitué de cellules hétérogènes (ronds en vert). Enfin lors de la repousse (5) le membre qui régénère est soumis à un patterning proximo-distal.

22 Peu de vertébrés sont capables d’une telle régénération. On retrouve ce phénomène chez les amphibiens notamment les urodèles (salamandres et axolotls) tout au long de leur vie et les anoures (xénope) à des stades précoces de leur développement. Chez les téléostéens on compte de nombreux spécimens dotés de ce potentiel de régénération. Parmi eux, le Danio rerio, espèce capable de régénérer ses nageoires tout au long de la vie.

Chez les mammifères adultes, ce potentiel régénération épimorphique n’existe pas, même si l’on retrouve chez la souris MRL adulte, ou chez la souris africaine Acomys des capacités de régénération « améliorées » (Clark et al., 1998; Seifert et al., 2012). Pourtant, les jeunes mammifères comme l’embryon de souris et la souris nouveau-née (Porrello et al., 2011) sont capables de régénérer un appendice entier. Ainsi, le potentiel de régénération épimorphique chez les mammifères serait perdu au cours du développement parallèlement à la complexification et la spécification des systèmes cellulaires et tissulaires des organismes. C’est pourquoi, afin de réactiver chez les mammifères adultes cette capacité extraordinaire de régénération qui existerait chez toutes les espèces dans les phases précoces de leur développement et qui est conservée tout au long de la vie de certains amphibiens et téléostéens, il est nécessaire de comprendre les mécanismes fondamentaux associés à ce processus. C’est dans ce contexte que s’inscrit mon projet de thèse qui vise à identifier les bases moléculaires et cellulaires du processus de régénération épimorphique en utilisant deux modèles : la nageoire caudale de la larve de zebrafish et le membre de l’embryon de souris.

La larve de zebrafish

Le zebrafish ou Danio rerio appartient à la classe des téléostéens, qui comprend la plupart des poissons actuels. C’est un petit poisson d’eau douce, originaire d’Inde utilisé depuis

23 longtemps dans le domaine de la biologie du développement, pour diverses raisons : sa petite taille et donc le coût réduit de sa maintenance, son développement externe et la transparence de ses larves qui rend possible l’observation directe des mécanismes cellulaires impliqués dans son développement, et la facilité et rapidité avec lesquelles on peut obtenir des lignées transgéniques, stables ou transitoires (Westerfield, M. (2000) The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 4th Edition. University of Oregon Press, Eugene). Récemment, le zebrafish est devenu un modèle de choix pour l’étude de la régénération. En effet, il est capable de régénérer entre autres: son pancréas, son foie, sa machoire, les cellules ciliées de la ligne latérale, son cœur, son système nerveux central et ses nageoires (Gemberling et al., 2013).

L’étude de la régénération de la nagoire caudale de la larve de zebrafish, est facilitée par la transparence de celle-ci et le fait qu’un grand nombre de larves puisse être obtenu, permettant l’étude à grande échelle de ce phénomène. De plus, les mécanismes qui régissent ce processus sont les mêmes que chez l’adulte (Kawakami et al., 2004). Or, une larve de trois jours est capable de régénérer sa nageoire en trois jours, alors que chez l’adulte le délai est de l’ordre de quelques semaines. C’est donc un modèle de choix pour étudier en détail le processus de régénération épimorphique chez les vertebrés. Il existe ainsi une littérature de plus en plus importante concernant les événéments moléculaires et cellulaires clés pour la repousse de la nageoire. Cependant, la formation du blastème, sa composition ainsi que les signaux critiques au processus de régénération restent encore mal décrits. Durant ma thèse, j’ai cherché à décortiquer les mécanismes régissant la régénération de la nageoire caudale dans ce modèle simple de vertebrés, en étudiant plus particulièrement à la mise en place du blastème.

24 L’embryon de souris

La souris (Mus musculus) est un mammifère qui pour l’étude de la biologie des cellules souches, et de la médecine régénératrice présente certains avantages. En effet, son potentiel de régénération épimorphique est comparable au notre ; c’est-à-dire largement restreint en ce qui concerne les membres. Des cas de régénération de la dernière phalange après amputation chez les enfants jusqu’à dix ans (Illingworth) ont été observés, et chez la souris la dernière phalange se régénère de manière similaire (Muneoka et al., 2008). Cependant, alors que la souris est capable de régénérer sa dernière phalange tout au long de sa vie, à l’age adulte l’homme ne l’est plus. Il nous parait important de comprendre pourquoi l’on perd cette capacité en vieillissant et d’identifier les mécanismes à l’origine de la restriction du potentiel de régénération. Pour étudier ces mécanismes nous nous avons utilisé le modèle d’embryon de souris qui, contrairement à la larve de zebrafish, ne peut régénérer son bourgeon de membre qu’à un stade de développement très précis.

En effet, il a été décrit une seule fois en 1991, (Lee and Chan, 1991) que l’embryon de souris au stade E10.5 était capable de régénérer après excision de son membre supérieur. Les auteurs décrivent qu’après excision du membre l’embryon est capable de repousser au 2/3. Le bourgeon régénéré reforme une AER (Apical epidermal ridge). Contrairement à la larve de zebrafish dont le développement est externe, l’étude de la régénération chez les embryons amniotes est techniquement plus difficile. Dans ce cas, nous avons recours à la culture ex vivo d’embryons de souris développée dans les année 1950 par New (New, 1978), qui permet de cultiver des embryons à des stades post implantatoires.

En utilisant cette technique de culture, nous nous sommes intéressés aux mécanismes cellulaires et moléculaires jouant un rôle dans la repousse du bourgeon de membre chez le

25 mammifère en mettant à profit nos connaissances sur la régénération de la larve de zebrafish. Nous avons cherché à identifier des mécanismes communs chez ces vertebrés, qui pourraient alors permettre à terme de transposer ces connaissances en médecine régénératrice.

1.2.3. Les étapes du processus de la régénération des membres

Formation de l’AEC

Après l’amputation du membre une courte phase de réparation tissulaire est engagée, avec la contraction de tissus lésés et la formation d’un épithélium de blessure (WE- « wound epithelium »), qui vont permettre de protéger celle-ci. Cette étape se déroule sans division cellulaire, consistant simplement en la migration des cellules épidermiques. Le remodelage de cet épithélium va laisser la place à une coiffe apicale, AEC, plus épaisse (Akimenko et al., 2003). Cette structure va proliférer et jouer un rôle de maintien voire d’induction de gènes nécessaires aux étapes suivantes du processus (Bryant et al., 2004). Sans cette structure, la régénération échoue et par exemple chez la salamandre, lorsque le membre est amputé et que la peau est suturée, l’AEC ne se forme pas et le membre reste à l’état de moignon (Whited and Tabin, 2009). Le rôle crucial de l’AEC est explicité dans le modèle dit de « membre accessoire » (ALM pour accessory limb model). Développé chez l’axolotl, ce modèle consiste en appliquant une greffe de peau sur le flanc de l’animal en déviant un nerf, et en le positionnant en interaction avec cette AEC artificielle. Ce simple contact suffit à stimuler la pousse d’un membre que l’on nomme ainsi accessoire (l’implication du nerf dans la régénération épimorphique sera développée plus loin).

26 Selon les espèces, et selon le stade de développement de l’organisme au moment de l’amputation, cette étape est plus ou moins rapide (Campbell and Crews, 2008). Chez la larve de zebrafish, le processus se déroule de manière similaire à d’autres organismes adultes. La régénération est complète en trois jours. Dans les dix premières minutes après l’amputation les cellules épithéliales de part et d’autre du site d’amputation se contractent. Ce phénomène est permis par la formation d’un anneau d’actine contractile, qu’on retrouve formé lors de la cicatrisation embryonnaire chez de nombreuses autres espèces. Cette contraction persiste jusqu’à trois heures après l’amputation. Par la suite la nageoire amputée redevient plate, et les cellules épithéliales s’accumulent dès 6 heures après l’amputation. Cette accumulation correspondrait à l’AEC qu’on retrouve chez les urodèles et amphibiens adultes (Kawakami et al., 2004). Chez l’embryon de souris, après excision de son bourgeon de membre à E10.5, le membre repousse. Les auteurs notent que dès 12h après culture la blessure s’est refermée. Il s’agit de l’étape de cicatrisation. Puis, 24h après culture, une analyse histologique révèle la présence d’une couche de cellules « ectodermiques », présentée comme l’«apical ectodermal ridge» (AER) par les auteurs (Lee and Chan, 1991). Par comparaison avec les modèles urodèles et zebrafish, il pourrait en fait s’agir de l’AEC. Ce modèle semble donc similaire dans les premières étapes du processus, aux espèces qui régénèrent.

1.2.3.1.1. Mécanismes moléculaires associés à la formation de l’AEC

L’AEC, qui possède un rôle clé dans l’initiation du processus de régénération, est une structure très proche en termes de structure et de fonction de l’AER qui permet le développement des membres chez les vertébrés. En effet, tout comme l’AER qui active la prolifération des cellules de la « progress zone» (PZ) (Pownall and Isaacs, 2010), une région

27 riche en cellules mésenchymateuses se situant en dessous de l’AER, l’AEC permet la formation d’une structure hautement proliférative critique pour le processus de régénération appelée blastème. Ces deux structures sont aussi semblables du fait de leur composition moléculaire et des voies de signalisation qu’elles activent pour permettre la croissance du membre pour l’une, et la mise en place du blastème pour l’autre.

Lors de l’étape de cicatrisation (c’est-à-dire avant la mise en place de l’AEC), les cellules épithéliales vont exprimer entre autres des métalloprotéinases matricielles (MMPs) qui vont permettre de remodeler l’épiderme et qui vont faciliter la mise en place des prochaines étapes, notamment la mise en place du blastème (Campbell and Crews, 2008). En effet, les MMPs jouent un rôle majeur dans la dégradation de la matrice extracellulaire. Il existe plus de 20 MMPs chez les mammifères. Celles-ci sont classées en fonction du substrat qu’elles dégradent et de leurs caractéristiques structurelles (Kato et al., 2003). On distingue ainsi, les gélatinases (MMP2,9), les stromélysines (MMP3,7,10,11), les collagénases (MMP 1,8,13) (Birkedal-Hansen, 1995). Chez les urodèles, les MMP3/10b sont détectées très précocement dans l’épithélium de blessure (WE). La MMP9 est détectée dès 2h post-amputation chez la salamandre puis est détectée plus tard dans le blastème, lorsque l’étape de cicatrisation se termine (Kato et al., 2003; Yang Eric V. et al., 1999). Chez la larve de zebrafish, on la retrouve au niveau de l’AEC. Il a été montré que l’expression de cette MMP était nécessaire à la régénération ; en utilisant des inhibiteurs spécifiques, des chercheurs ont montré une inhibition de la régénération. Cependant, MMP9 ne serait pas directement impliquée dans les étapes de prolifération mais plutôt dans la fonctionnalité de l’AEC. En effet, en l’absence de MMP9 la formation de l’AEC et la mise en place du blastème seraient inhibées (Yoshinari et al., 2009).

28 Lorsque l’étape de cicatrisation est terminée, l’AEC va jouer son rôle de chef d’orchestre et permettre la repousse des membres, à travers notamment un dialogue moléculaire étroit avec le blastème impliquant de nombreux facteurs décrits ci-dessous.

Les membres de la famille « Bone morphogenetic protein » (BMPs), comme ceux de la famille « Fibroblast growth factors » (FGFs), sont impliqués dans le développement du membre chez les vertébrés. De plus, de nombreuses BMPs sont exprimées au niveau de l’AER. Chez le poulet notamment, on retrouve les BMP2, 4, 7, exprimées au niveau de l’AER et nécessaires à la formation des structures distales du membre (Capdevila et al., 1999). Chez la souris nouveau-née, lorsque des billes recouvertes avec BMP2 ou BMP7 sont injectées au niveau de la blessure, une réponse régénérative est induite au niveau de la dernière phalange (Yu et al., 2010). Ce même effet n’est pas retrouvé après injection de billes coatées avec BMP4. Chez l’axolotl, la même expérience avec FGF2, FGF8 et GDF5 (BMP14) est suffisante pour induire la formation d’un blastème, en l’absence d’AEC (Makanae et al., 2013). Chez le zebrafish, la BMP2b est exprimée au niveau de l’épiderme (Avaron et al., 2013; Smith et al., 2006).

Les gènes appartenant à la famille des « muscle segment homeobox » (msx), bien connus des développementalistes et découverts chez la drosophile, sont exprimés au cours du processus de régénération. Chez le mammifère, on retrouve deux membres de cette famille s’exprimant au cours du développement embryonnaire : msx1 et msx2. Ces derniers seraient impliqués dans les interactions épithélio-mésenchymateuses, lors de la croissance et morphogenèse du tissu et, de façon intéressante ils participeraient également à la spécification d’une structure embryonnaire : la crête neurale (CN). Au cours du développement du membre des embryons de souris, au stade E11.5, msx1 est exprimé au niveau du mésenchyme, alors que msx2 est exprimé au niveau de l’AER. Chez le zebrafish, on compte au moins 5 gènes de la famille msx : msxa, b, c, d, e. Les membres de cette famille de gènes participent au développement des

29 nageoires chez la larve de zebrafish ainsi qu’à leur régénération (Akimenko et al., 1995). Msxa et msxd sont exprimés au niveau de l’AEC, et pourraient donc avoir le même rôle que msx2 chez le mammifère. Ces gènes sont des cibles directes de la voie BMP. Par exemple, BMP4 a été décrit comme pouvant induire l’expression des gènes msx, dans l’épiderme, le mésenchyme du membre, le tube neural et le mésoderme ventral (Tríbulo et al., 2003). Il est donc fortement suggéré que la voie BMP joue un rôle clé dans l’expression des gènes msx au cours de la régénération.

Les membres de la famille DLX (distal less), très conservés, possèdent un domaine homeobox et interviennent dans le développement du cerveau, des arcs branchiaux, des membres, de l’oreille interne mais également chez l’adulte mammifère au niveau de la peau et des ovaires. Chez le zebrafish et la souris, au cours du développement, dlx3 est exprimé, respectivement, dans l’extrémité de l’épiderme de la nageoire et du membre et serait impliqué dans les interactions épiderme-mésenchyme (Akimenko et al., 2003; Kraus and Lufkin; Morasso et al., 1995). Chez la salamandre, dlx3 est exprimé au cours de la régénération, selon un gradient proximo-distal (Mullen et al.). Chez la larve de zebrafish, dlx4 est exprimé dans l’AEC mais pourrait jouer un rôle plus tardif notamment pour la mise en place de la polarisation proximo-distale (Akimenko et al., 2003).

La voie FGF est elle-même impliquée dans la régénération et notamment lors de la formation de l’AEC. Cette voie est déjà connue pour être activée très largement lors du développement des membres chez les vertébrés, notamment au niveau de l’AER, où l’on a décrit l’expression restreinte de FGF4 et FGF8,9, 17 chez la souris(Pownall and Isaacs, 2010). On a décrit précédemment que l’action synergique de BMP14, FGF2 et 8, chez la salamandre permettait, après excision de l’AEC, de former un blastème. L’embryon de poulet n’est pas capable de régénérer son bourgeon de membre ; et ce, probablement en raison de son incapacité

30 à former une AEC fonctionnelle. Cependant, ce déficit peut être pallié en appliquant FGF4 ou FGF2 (Kostakopoulou et al., 1996; Taylor et al., 1994) au contact du mésenchyme, recréant ainsi une signalisation fonctionnelle et permettant la réinduction de msx1, dans le mésenchyme.

Fgf20a chez le zebrafish, est détecté dans l’épithélium de blessure. Les mutants FGF20a ne

forment pas de blastème, ce qui est en accord avec le rôle critique de FGF20a dans la formation d’une AEC fonctionnelle elle-même clé dans le processus de régénération (Whitehead et al., 2005). Encore une fois, il y a nécessité d’un dialogue étroit entre l’AEC et le mésenchyme sous-jacent. Par exemple, l’activation de la voie FGF, dans le blastème, est nécessaire à la maintenance de FGF20a au sein de l’AEC et donc au processus de régénération (Shibata et al., 2016). L’expression de fgf20a est également nécessaire à la maintenance de l’expression de

lef1 cible de la voie Wnt/βcaténine, dans l’AEC (Figure 3.).

L’activine A, un membre de la famille TGFβ (« Transforming growth factor), est notamment connue pour son rôle dans la maintenance de l’état de pluripotence des cellules souches embryonnaires (James et al., 2005). Chez le zebrafish, l’activine A est exprimée au cours du processus de régénération, notamment lors de la phase de cicatrisation permettant la migration des cellules épithéliales et la mise en place de l’AEC. De plus, bien que fgf20a

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