Formalisme d’ Hoffman et Lauritzen

O desenvolvimento de materiais dentários com diferentes composições químicas, propriedades e recomendações de aplicação clínica tem sido constantemente introduzido na Odontologia. No entanto, a maioria destes materiais entra em contato ou interage com o tecido conjuntivo e com fluidos tissulares, de maneira que a seleção de um novo material deve considerar não somente suas propriedades mecânicas e físico-químicas, mas também a sua compatibilidade biológica (Souza-Costa et al., 2003; Cavalcanti et al., 2006; Bae et al., 2010; Camargo et al., 2014a; Candeiro et al., 2015; Saberi et al., 2016).

A citotoxicidade e genotoxicidade de materiais em cultura de células pode ser analisada pelo método direto ou indireto. No método direto a cultura celular se prolifera em contato diretamente com o material (Bouillaguet et al., 2002; Perez et al., 2003), o que se aproximaria de situações in vivo. Entretanto este método pode

influenciar na viabilidade celular através de danos mecânicos às células ou

contaminações que podem ser resultantes da dificuldade de esterilizar um material sem alterar suas propriedades (Schmalz, 1994). Já, no método indireto os espécimes são preparados e colocados em uma solução na qual os materiais são capazes de liberar suas substâncias formando extratos (Schmalz, 1994; Küçükkaya et al., 2016).

Em diversos estudos na Literatura (Huang, Chang 2002; Bouillaguet et al.,

2002; Schmalz, 2002; Cavalcanti et al., 2005; De-Deus et al., 2005; Schweikl et al., 2005a; Demirci et al., 2008; Zhou et al., 2013; Küçükkaya et al., 2016) e nos artigos 3.1 (Camargo et al., 2009), 3.2 (Camargo et al., 2009) e de 3.4 a 3.7 (Bin et al., 2012; Camargo et al., 2014; Silva et al., 2015; Camargo et al.), a citotoxicidade e genotoxicidade de materiais dentários foram avaliadas utilizando extratos originais obtidos a partir destes materiais (método indireto).

O comportamento biológico de materiais dentários deve ser avaliado em três etapas (Accorinte et al., 2005). A primeira etapa consiste na análise de um material

realizando uma série de experimentos de citotoxicidade in vitro. Em segundo, avaliar se o material testado é um agente tóxico in vivo, o que pode ser realizado por meio da implantação subcutânea em animais e análise da reação tecidual local. Finalmente, os efeitos in vivo do material sobre as células do tecido alvo devem ser avaliados em animais ou seres humanos (Tai et al., 2001; Huang, Chang, 2002; Sousa et al., 2004). Alguns autores também estão de acordo que testes in vivo e in vitro devem ser realizados para a avaliação do comportamento biológico de materiais (Schmalz, 1994; Perez et al., 2003; Queiroz et al., 2011), entretanto, Souza-Costa et al. (2003) relataram que os testes in vivo são mais aceitáveis para avaliar a biocompatibilidade de materiais dentários.

A implantação subcutânea ou óssea de materiais em animais e a avaliação da reação tecidual local é um teste in vivo bastante utilizado para verificação da biocompatibilidade (Graça et al., 2014). Como foi observado no artigo 3.3 (Camargo et al., 2010), onde dois tipos de materiais (hidróxido de cálcio e polímero da mamona - COB) foram implantados no subcutâneo de ratos Wistar para a análise de biocompatibilidade. Neste estudo, foi verificado que após 50 dias de contato o COB induziu menor resposta inflamatória, mostrando adequada biocompatibilidade. Graça et al. (2014) também observaram que o polímero da mamona associado ao

carbonato de cálcio (CaCO3), apresentou diminuição de células inflamatórias de 7

para 40 dias, e o hidróxido de cálcio apresentou um infiltrado de células inflamatórias moderado, como também foi evidenciado por Queiroz et al. (2011).

Modelos in vitro de cultura celular tem sido utilizados para análise de citotoxicidade de materiais que se pretende utilizar em seres humanos (De-Deus et al., 2005). Estes modelos são simples, reprodutíveis, possuem baixo custo, sendo relevantes e satisfatórios na avaliação de propriedades biológicas básicas de materiais dentários (Huang, Chang, 2002). Desta forma a avaliação da citotoxicidade in vitro de diferentes materiais odontológicos pode ser realizada.

No artigo 3.1 (Camargo et al., 2009), foram avaliados materiais utilizados no capeamento pulpar, como o mineral trióxido agregado (MTA). Após 24 h de exposição às células pulpares humanas, foi verificado que o extrato original (1:1) do MTA cinza (Angelus) causou uma diminuição na sobrevivência celular, mas não foi considerado citotóxico. Por outro lado, o MTA branco exibiu uma alta sobrevivência

relataram também que o MTA branco é capaz de alta vialbilidade celular em diferentes tipos de células e ensaios de citotoxicidade (Bin et al., 2012 (artigo 3.4); Slompo et al., 2015; Küçükkaya et al., 2016; Garcia et al., 2016). Semelhante a estes estudos, Paranjpe et al. (2010) e Saberi et al. (2016) verificaram que o MTA não apresentou citotoxicidade sobre células tronco da polpa dentária (DPSC) e células da região apical (SCAP), promovendo alta proliferação celular.

Em relação ao estudo de cimentos endodônticos, a busca por materiais com propriedades fisico-químicas e biológicas ideais tem sido constante e tem gerado resultados que podem direcionar a escolha de um cimento adequado para a prática clínica. Dentre as características biológicas, a análise de citotoxicidade pode ser uma ferramenta de grande valor. No artigo 3.4 (Bin et al., 2012), quando foi estudado o cimento endodôntico à base de MTA (MTA Fillapex), observou-se uma redução das taxas de sobrevivência celular após 12 e 48 h em contato com fibroblastos pulmonares de hamster chinês (V79). Silva et al. (2013) e Braga et al. (2014) também observaram uma citotoxicidade moderada para o MTA Fillapex, em contrapartida, Zhou et al. (2013) relataram que o cimento ProRoot MTA apresentou viabilidade celular acima de 60% após 1, 3 ou 7 dias de contato com fibroblastos gengivais.

Nos artigos 3.2 (Camargo et al., 2009) e 3.6 (Silva et al., 2015), foram testados os cimentos AH Plus, Epiphany, EndoREZ, Real Seal SE, sendo que todos foram citotóxicos apenas na maior concentração (1:1) avaliada, no entanto, o cimento Acroseal continuou altamente tóxico em concentrações menores. Karapınar-

Kazandağ et al. (2011) também verificaram que os cimentos AH Plus, Epiphany,

EndoREZ e Roeko Seal não foram citotóxicos após 24 h em contato com células pulpares, por outro lado, Silva et al. (2013) encontraram moderada citotoxicidade

para AH Plus e Epiphany. Nos estudos de Camargo et al. (2014a) e Pawińska et al.

(2015), foi demonstrado que o Epiphany apresentou baixa viabilidade celular, menor que 30%, sendo considerado um material altamente citotóxico. Os cimentos AH Plus, Acroseal, EndoREZ, Real Seal SE, MTA Fillapex apresentaram toxicidade em altas concentrações e a medida que foram diluídos a citotoxicidade diminuiu acentuadamente (Van Landuyt et al., 2012; Eldeniz et al., 2015).

Produtos fitoterápicos tem sido utilizados frequentemente no tratamento ou prevenção de doenças. Entretanto, muitas espécies de plantas sintetizam

substâncias químicas tóxicas, aparentemente para utilizarem como defesa primária contra bactérias, fungos, insetos e outros predadores. Por isso é importante avaliar os possíveis efeitos citotóxicos e genotóxicos destes produtos antes da sua utilização em seres humanos na prática clínica (Maistro et al., 2004).

Na Odontologia, também o interesse por materiais fitoterápicos tem aumentado e alguns destes já estão sendo utilizados nos procedimentos clínicos. O polímero derivado do óleo de mamona (Castor oil bean ou Castor oil polymer) tem sido utilizado como preenchimento de retrobturações em cirurgias paraendodônticas, cimento obturador de canais radiculares (Pascon et al., 2001) e como agente irrigante (Ferreira et al., 2002; Souza-Junior et al., 2004). Outro material também utilizado na área odontológica é o óleo de Copaíba (Copaifera multijuga), o qual apresenta propriedades antiflamatória, antisséptica, antibacteriana e antifúngica (Garrido et al., 2015).

De acordo com o artigo 3.3 (Camargo et al., 2010) a biocompatibilidade in vivo do polímero derivado do óleo da mamona (COB, Poliquil) comparado ao hidróxido de cálcio (HC) foi avaliada em tecidos subcutâneos de ratos e foi evidenciado que o COB induziu menor resposta inflamatória em longos períodos de observação podendo, portanto, ser um material mais biocompatível em procedimentos odontológicos. Em adição, no artigo 3.1 (Camargo et al., 2009) foi observado in vitro que o COB não foi citotóxico para as células pulpares humanas, uma vez que, a taxa de sobrevivência celular no extrato original (105,2%) foi significantemente maior quando comparado ao grupo controle, sugerindo que este material foi capaz de promover proliferação celular. De acordo com os resultados obtidos neste estudo, em que o COB apresentou comportamento biológico excelente para as células humanas da polpa dentária, este material possui um potencial para ser utilizado na prática odontológica.

Foram ainda avaliados cimentos endodônticos fitoterápicos, sendo o cimento Castor Oil Polymer (COP, Polifil) considerado isento de citotoxicidade (Artigos 3.2 e 3.6). De acordo com estes artigos (Camargo et al., 2009; Silva et al., 2015), o COP promoveu alta taxa de sobrevivência tanto sobre células pulpares como em células V79. No artigo 3.6 (Silva et al., 2015) também foi testado o cimento endodôntico à base de Copaíba e, com exceção da diluição mais concentrada (1:1), o mesmo pode

cimento de Copaíba não pode ser considerado citotóxico, uma vez que apresentou taxa de viabilidade próximo de 100%.

Contudo, investigações de citotoxicidade in vitro por meio de testes enzimáticos ainda podem ser limitadas para caracterização de algumas alterações que os materiais dentários podem causar nas células eucarióticas (Schweikl et al., 2006). Portanto, a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs) por células eucarióticas na presença de materiais dentários é um indicativo do potencial oxidativo destes materiais (Spagnuolo et al., 2006).

Os organismos aeróbicos produzem e degradam EROs, originando tanto concentrações fisiológicas (resultantes da realização de funções celulares fisiológicas), como quantidades excessivas que, ao superarem as defesas antioxidantes naturais dão origem a um estado denominado estresse oxidativo (Nordberg, Arnér, 2001). No artigo 3.1 (Camargo et al., 2009), MTA cinza, MTA branco e COB não promoveram aumento dos níveis de EROs em nenhuma das diluições testadas em relação ao grupo controle negativo. Em contrapartida, Ribeiro et al. (2010) verificaram que o MTA foi capaz de gerar EROs em altas concentrações, induzindo a morte de bactérias.

No artigo 3.2 (Camargo et al., 2009), com exceção do COP, todos os outros cimentos (AH Plus, Epiphany, Acroseal) foram capazes de aumentar os níveis de EROs sobre células pulpares. Desta forma, sugere-se que o fato do COP não ter produzido EROs pode estar relacionado à sua baixíssima toxicidade. Alguns estudos observaram aumento de produção de EROs pelo cimento MTA Fillapex em macrófagos (Braga et al., 2014) e aumento dos níveis de EROs para os cimentos AH 26, Pulp Canal Sealer, CAPSEAL I e CAPSEAL II em células humanas do ligamento periodontal (Bae at al., 2010).

O potencial genotóxico de materiais dentários pode ser avaliado por meio do teste de micronúcleos (MNT) o qual é capaz de verificar a quantidade de micronúcleos, que são fragmentos pertencentes ao DNA celular que se desprendem durante a divisão celular. A formação destes micronúcleos indica que houve alteração irreversível do DNA durante a replicação celular (Schweikl, Schmalz, 2000). No artigo 3.1 (Camargo et al., 2009), o HC, MTA e COB não foram capazes de aumentar o número de micronúcleos significativamente em relação ao grupo tratado com etilmetanosulfanato (EMS) (controle positivo). Estes materiais

apresentaram um número de micronúcleos semelhante ao grupo não tratado (controle negativo), indicando que estes materiais não foram genotóxicos nas condições experimentais do estudo.

No artigo 3.2 (Camargo et al. 2009), os cimentos endodônticos Acroseal, Epiphany e AH Plus foram capazes de aumentar o número de micronúcleos evidenciando o potencial mutagênico destes materiais. Semelhantemente, no artigo 3.4 (Bin et al., 2012) foi verificado que os cimentos endodônticos AH Plus e o MTA Fillapex foram também genotóxicos, evidenciando que são capazes de estimular danos genéticos ao DNA celular. Em adição, AH Plus, EndoREZ e RoekoSeal foram capazes de causar danos ao DNA celular pelo teste de cometa (Camargo et al. 2014a) e o cimento AH Plus apresentou genotoxicidade para fibroblastos gengivais humanos (Candeiro et al., 2015).

Por outro lado, Brzovic et al. (2009) testaram uma variedade de cimentos endodônticos, incluindo o Epiphany e verificaram que nenhum cimento foi genotóxico sobre linfócitos humanos pelo ensaio de cometa. Os cimentos AH Plus, Acroseal, RealSeal, MTA Fillapex e EndoREZ não causaram alteração significativa no DNA celular quando testados pelo ensaio de imunofluerêscência c-H2AX (Van Landuyt et al., 2012; Eldeniz et al., 2015). No artigo 3.6 (Silva et al., 2015) foi verificado que os cimentos COP (Polifil) e de Copaíba não foram genotóxicos, apresentado baixa formação de micronúcleos.

Alguns materiais dentários são capazes de alterar o ciclo celular normal das células eucarióticas e causar dano irreversível ao DNA celular e/ou induzir morte celular por necrose ou apoptose. A técnica de citometria de fluxo permite a quantificação de células em apoptose e determina a porcentagem de células viáveis

em cada fase do ciclo celular após a exposição a um material (Moghaddame-Jafari

et al., 2005).

O ciclo celular, período entre duas divisões mitóticas, consiste em uma seqüência ordenada de fases extremamente reguladas: G1, S, G2 e M. A fase G1 é caracterizada por expressão de genes e síntese de proteínas o que permite o crescimento celular e a produção das proteínas necessárias para a síntese do DNA. Durante a fase S, a célula realiza a replicação do DNA e na fase G2 ocorre novamente o crescimento celular e síntese de proteínas para o processo de divisão.

originando duas células-filhas. Após o término desta fase, a célula tem duas opções, entrar na fase G1 e iniciar outro ciclo celular ou entrar em estado de latência (G0).

Os pontos de controle (checkpoints) do ciclo celular são caminhos regulatórios para monitorar o completo sucesso das fases G1, S e G2 das células eucarióticas. Pontos de controle intactos irão ativar respostas celulares ao dano do DNA por fatores endógenos e exógenos por meio das atividades reguladas de proteínas sensoras, transdutoras e efetoras. As células podem atrasar a ação dos pontos de controle para permitir o reparo do dano celular ou a inativação de fatores de estresse celular. Entretanto, defeitos nos sinais dos pontos de controle podem conduzir a um dano celular irreversível como mutação genética e dano cromossômico (Schweikl et al., 2005b).

No artigo 3.1 (Camargo et al., 2009), o COB não apresentou influência sobre o ciclo celular das células V79, uma vez que, não foram identificadas mudanças no padrão de distribuição entre as fases G1, S e G2 em relação ao grupo controle. Contudo, o extrato original do MTA cinza mostrou uma significante diminuição do número de células da fase S e um aumento na fase G2 comparado ao grupo controle negativo.

No artigo 3.2 (Camargo et al., 2009), houve detecção no atraso do ciclo celular de células expostas ao cimento endodôntico Acroseal. Ainda, Xu et al. (2010) verificaram que os cimentos Real Seal e AH Plus foram capazes de aumentar o número de células na fase G1 do ciclo celular da linhagem MG-63. Valois e Azevedo (2008) observaram atraso no ciclo celular de fibroblastos 3T3 na presença de AH Plus, Endofill e Sealer 26.

Em 2013, ainda dentro da linha de pesquisa relacionada à análise da biocompatibilidade de materiais, foram realizados dois estudos para avaliação de dentifrícios disponíveis comercialmente.

Os dentifrícos com função clareadora tem sido bastante utilizados pela população, portanto a avaliação de sua biocompatibilidade torna-se particularmente importante. Desta forma, o artigo 3.5 (Camargo et al., 2014) avaliou a citotoxicidade e genotoxicidade de dois dentifrícios clareadores (Colgate Whitening e Oral-B Whitening) e foi observado que ambos dentifrícios foram capazes de induzir citotoxicidade para fibroblastos gengivais humanos, diminuindo acentuadamente a taxa de sobrevivência celular. Além disso, estes dentifrícios também foram

considerados genotóxicos, por terem aumentado a formação de micronúcleos em

relação ao grupo controle negativo. Diferente deste estudo, Eyüboğlu et al. (2015)

avaliaram um dentifrício clareador (Clinpro White Varnish), porém evidenciaram que o mesmo não foi citotóxico para fibroblastos gengivais.

No artigo 3.7 (Camargo et al.) foi avaliada a citotoxicidade, genotoxicidade e atividade antimicrobiana de dentifrícios com ação dessensibilizante, o Colgate Sensitive, Oral B Sensitive e Sensodyne. Com relação a citotoxicidade, foi verificado que o Colgate Sensitive foi o dentifrício menos citotóxico, apresentando valores de proliferação acima de 75% em todas as diluições. No entanto, Oral B Sensitive e Sensodyne foram bastantes citotóxicos para os fibroblastos gengivais. Quanto à genotoxicidade, nenhum dentifrício avaliado proporcionou formação de micronúcleos em fibroblastos gengivais humanos. Souza-Rodrigues et al. (2015) e Cvikl et al. (2015) constataram que o Sensodyne não foi citotóxico, apresentado alta taxa de viabilidade celular (> 80%) em fibroblastos gengivais humanos. Enquanto que

Eyüboğlu et al. (2015) verificaram que dois dentifrícios dessensibilizantes Systemp

Desensitizer e Colgate Sensitive Pro-Relief apresentaram moderada e baixa citotoxicidade, respectivamente, para fibroblastos gengivais e pulpares.

Ainda no artigo 3.7 (Camargo et al.), foi observado que os dentifrícios dessensibilizantes compostos por arginina (Colgate Sensitive), cloreto de estrôncio (Sensodyne) ou fluoreto de sódio (Oral B Sensitive) apresentaram moderada atividade antimicrobiana para C. albicans, S. mutans e S. aureus. Enquanto que, um dentifrício composto por triclosan (Colgate) foi o que causou maior inibição do crescimento de todos os microorganismos avaliados. Também, De Rossi et al. (2014) verificaram que os dentifrícios contendo triclosan, clorexidina ou extratos naturais apresentaram alta atividade antimicrobiana contra S. mutans e C. albicans. Dentifrícios à base de fluoreto de sódio apresentaram alta atividade antifúngica para C. albicans (Adwan et al., 2012).

Evans et al. (2015) observaram que um dentifrício à base de fluoreto de estanho (Oral B Pro Health) e outros contendo triclosan (Oral B Tooth & Gums e Colgate) promoveram inibição do crescimento de S. mutans e S. sanguinis. Randall et al. (2015) verificaram que o Colgate apresentou alta atividade antimicrobiana contra S. mutans.

Sabe-se que os mecanismos celulares in vivo podem minimizar os efeitos deletérios dos dentifrícios, bem como os fatores do ambiente bucal como a saliva, que pode neutralizar alguns componentes presentes nestes produtos. No entanto, os resultados destes estudos podem ajudar na escolha do dentífricio ideal.

Testes in vitro são muito úteis para analisar os efeitos biológicos de materiais dentários, porém podem ser limitados na sua capacidade para simular uma condição clínica (Huang, Chang, 2002a; Küçükkaya et al., 2016). Além disso, testes in vitro não estimulam as reações de defesa dos tecidos como inflamação, respostas imunológicas do organismo ou outros mecanismos de reparo (Galler et al., 2005). Ainda, existem importantes pontos a se considerar em um experimento in vitro, como a escolha do tipo celular adequado, o número de passagem e o tipo de ensaio (Küçükkaya et al., 2016). No entanto, é necessário continuar investigando os materiais dentários buscando um material que apresente propriedades ideais in vitro (Huang, Chang, 2002a, Küçükkaya et al., 2016). Contudo, materiais que não apresentem reações indesejáveis em testes in vitro têm potencial para ser inócuo ao tecido se outros fatores como contaminação bacteriana pudessem ser excluídos (Galler et al., 2005). Ainda, os resultados obtidos em ensaios in vitro podem ser indicativos para os efeitos observados in vivo (Ribeiro et al., 2006; Küçükkaya et al. 2016).

Portanto, os testes em cultura celular para avaliação da toxicidade de materiais dentários é uma valiosa ferramenta para a compreensão do comportamento biológico destes materiais, desde que as limitações do método sejam levadas em consideração, especialmente na interpretação dos resultados.

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Candeiro GT, Moura-Netto C, D'Almeida-Couto RS, Azambuja-Júnior N, Marques