1. Fluorimétrie PAM

Les fluorimètres PAM sont des outils permettant la mesure des variations de fluorescence chlorophyllienne (la fluorescence du PSII), dont l’explication ici se base majoritairement sur deux revues Consalvey et al. (2005), Murchie et Lawson (2013).

La fluorescence est la réémission de photons captés sous forme de photons d’un niveau énergétique plus faible. La chlorophylle a réémet dans le spectre lumineux rouge. En absence de lumière, les centres réactionnels du PSII sont dit ‘ouverts’, c’est-à-dire qu’ils sont prêts à recevoir des électrons pour effectuer la séparation de charges. Le niveau de fluorescence est minimal (F₀). Si on applique alors un court flash lumineux suffisant pour fermer tous les centres réactionnels PSII (appelé impulsion de saturation ou ‘saturating pulse’), on atteint une fluorescence maximale (Fm). La différence entre ces deux mesures nous donne le potentiel de fluorescence (Fv = Fm - F0). Dans ces conditions, il est facile de calculer le rendement quantique du PSII (Fv / Fm), qui est communément utilisé pour estimer ‘l’état de santé’ des organismes photosynthétiques.

En présence de lumière dite actinique (capable de stimuler la photosynthèse), les photons vont atteindre l’antenne collectrice d’énergie lumineuse et donc entrainer une acceptation d’électrons par les centres réactionnels PSII. Le signal de fluorescence mesuré sans autre stimulation que la lumière ambiante est donc situé entre F0 et Fm (Fs ou F’). Fs est proportionnel à la quantité de centres réactionnels PSII fermés. Si on applique un sat-pulse, on atteint un niveau de fluorescence supérieur à Fs, et inférieur à Fm (Fm’) lorsque l’intensité de la lumière actinique est suffisamment forte (en excès de la capacité photosynthétique de l’organisme). Le fait que le Fm’ soit inférieur au Fm est dû au NPQ qui dissipe une partie de l’énergie envoyée au PSII (voir plus bas) (Figure 39).

Figure 39 : Lors de

l'augmentation du

NPQ (3), il y à augmentation de la fluorescence (1)

Sur un échantillon adapté à la lumière, la différence entre le niveau de fluorescence a un niveau particulier Fs (ou F’) et Fm’ est défini comme la fluorescence qui a été utilisée dans la photochimie (Fq’ = Fm’ - Fs). Il est proportionnel au nombre de centres réactionnels PSII ouverts et, par conséquent, à la quantité d’énergie lumineuse utilisée pour la photochimie. Si Fq’ est ramené à Fm’, on calcule alors le rendement photochimique du PSII ou ΦPSII = (Fm’ - Fs) / Fm’.

L’utilisation des différents niveaux de fluorescence permet de calculer de nouveaux paramètres qui permettent d’aller plus loin dans l’évaluation de l’activité photosynthétique. En augmentant progressivement l’intensité lumineuse, l’efficacité de son utilisation diminue car de plus en plus de centres réactionnels PSII sont fermés, ce qui entraine une diminution de l’émission de fluorescence. Ceci est réalisé lors de RLCs ou Rapid Light Curves (cf Parties 2, 3, 5A, 6) lors desquelles l’intensité de la lumière actinique est progressivement augmentée (par paliers de 30 s ; Lefebvre et al. (2011)) jusqu’à un maximum qui permet de saturer la

photochimie. De cette manière, le taux de transport d’électrons photosynthétique (ETR : Electron Transport Rate en µmol e^- µg chl a^-1 s^-1) peut être calculé en utilisant les précédents paramètres relatifs à l’efficacité d’utilisation de la lumière : ETR = Φ PSII x E x a*

ou E est l’intensité lumineuse (µmol m-2

s^-1), et a^* le coefficient d’absorption de la lumière (m² µg chl a^-1). Dans les cas où le paramètre a^* ne peux pas être mesuré (ce qui est souvent le cas avec le microphytobenthos), on parle alors de taux de transport d’électron relatif : rETR = Φ PSII x E x 0.5, le facteur 0.5 provenant des connaissances issues des plantes et étant utilisé par défaut pour exprimer le fait que seulement la moitié de l’énergie lumineuse absorbée est utilisée pour la photochimie. Chez les diatomées, ce paramètre est très variable d’une espèce à l’autre et en fonction des conditions d’acclimatation environnementale, c’est donc souvent qu’il n’est pas utilisé.

Figure 40 : Représentation schématique des niveaux de fluorescence chlorophyllienne mesurés par fluorimétrie PAM.

La diminution de l’émission de fluorescence chlorophyllienne peut aussi être, dans des conditions de lumière actinique constante, observée lorsque l’on soumet les échantillons à un stress, en particulier un excès de lumière (Figure 40). Ceci est réalisé lors de NSLCs ou

Non-pendant 5 minutes (temps nécessaire à la stabilisation de F_s). L’intensité est augmentée jusqu’à un maximum qui sature la photochimie mais à la différence des RLCs, un nouvel échantillon est utilisé pour chaque pas d’intensité. De cette manière, le développement optimal du NPQ peut être évalué contrairement aux RLCs. Néanmoins, les NSLCs peuvent être utilisées au laboratoire mais pas in situ ; dans ces conditions NPQ est également évalué par RLCs. Il requiert une connaissance du Fm et donc une acclimatation préalable des échantillons à l’obscurité (pour générer l’ouverture de tous les centres réactionnels PSII). Il correspond à la différence entre le niveau de fluorescence maximal atteint à l’obscurité (Fm) et à la lumière (Fm’) ramené à ce dernier : NPQ = (Fm – Fm’) / Fm ; NPQ n’a pas d’unité. Lorsque l’acclimatation des échantillons à l’obscurité n’est pas possible (comme par exemple dans le cas du biofilm épipélique où l’obscurité provoque un changement de biomasse en surface du sédiment) et la mesure d’un ‘vrai’ Fm impossible, la plus forte valeur de Fm’ de la RLC (Fm’max) est utilisée comme proxi de Fm (Lefebvre et al., 2011).

Les courbes rETR et NPQ en fonction de l’intensité lumineuse, ETR-E et NPQ-E peuvent être paramétrées par modélisation mathématique (Eilers et Peeters, 1988, Serôdio et Lavaud, 2011). Les paramètres ainsi dérivés des courbes ETR-E sont 1) le rETR maximal (rETR_m) qui est l’asymptote de la courbe, 2)  qui est la pente à l’origine et représente l’efficacité d’utilisation de la lumière, 3) Ek = rETRm /  qui représente le coefficient de saturation de la lumière. Pour les courbes NPQ-E : 1) le NPQ maximal (NPQ_m), 2) E₅₀NPQ, l’E nécessaire pour atteindre 50 % de NPQm, 3) n qui est le coefficient de sigmoïdicité de la courbe et qui représente l’efficacité d’induction du NPQ.