étude, nous citerons l'endoxylanase de 39 Kda produite par Clostridium thermolacticum (Debeire et al. 1990) qui libère des xylo-oligosaccharides obtenus à partir des glucuronoxylanes de mélèze. De degrés de polymérisation variables, ils sont substitués par un acide 4-0-méthyl-glucuronique. Des produits de réaction encore plus complexes sont libérés, pour exemple le cas d'une endoxylanase purifiée de Thermobacillus xylanilyticus qui en plus du xylobiose et du xylotriose à partir de la paille de blé, produit aussi des arabinoxylo-oligosacharides de degré de polymérisation supérieur à 2, substitués ou non par l'acide férulique (Lequart et al. 1999).
Les propriétés physicochimiques des arabinoxylanes, telles que la solubilité, peuvent également influencer l'efficacité des endoxylanases. Il existe une corrélation positive entre le degré de substitution et la solubilité dans l'eau. En effet, plus les xylanes sont substitués, plus ils seront solubles car capables grâce à leurs substituants, d'établir des liaisons faibles avec les molécules d'eau.
4.2 Les Ji-xylosidases et enzymes accessoires
Les enzymes nécessaires à la dégradation complète du polymère d'arabinoxylane du son de blé en monomère ou petits oligomères sont succinctement décrites ci dessous.
-Les (3-xylosidases (EC 3.2.1.37) sont, à la différence des endoxylanases, des exoglycosidases. Elles hydrolysent les xylo-oligosaccharides de faible degré de polymérisation à partir de leur extrémité réductrice et de manière générale, n'attaquent pas les polymères de xylanes. Cependant, de rares exemples montrent l'aptitude de certaines 13-xylosidases à libérer très lentement du xylose à partir de xylanes (Dekker et Richards 1976).
-Les a-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.2.55)
Ce sont des exo-enzymes capables d'hydrolyser les liaisons a reliant les L-arabino-furanosyles de la chaîne latérale des arabinanes, des arabinogalactanes et des arabinoxylanes (Kaji 1984). Agissent principalement sur des oligosaccharides de faible degré de polymérisation, plus rarement sur des polymères (Poutanen 1988b), Greve et al. (1984) ont observé que l'arabinose serait une restriction à la dégradation des arabinoxylanes par les endoxylanases. Son action dénude la chaîne principale et permet la création de nouveaux sites
pour l'action des xylanases. Néanmoins, actuellement peu de données existent sur des arabinofuranosidases capables d'agir efficacement sur les disubstitutions d'arabinose portées par les xyloses de la chaîne principale.
-Les a-D-glucuronosidases (EC 3.2.1.139)
Ce sont des exo-enzymes, capables de couper les liaisons entre l'acide glucuronique (ou son dérivé 4-0-méthylé) et le xylose de la chaîne principale qui le porte. Principalement actives sur des glucuronoxylo-oligomères de faible degré de polymérisation (Johnson et al.1989) elles peuvent néanmoins libérer lentement de l'acide 4-O méthylglucuronique à partir de
glucuronoxylanes.
-Les acétyle estérases (EC 3.1.1.6)
Ces enzymes libèrent des groupements acétyles liés en position C-2 ou C-3 d'un xylose, et comme pour beaucoup d'autres enzymes accessoires, sont souvent peu actives sur de longues chaînes de xylose, mais plus efficaces sur des xylo-oligosaccharides. De nombreuses acétyle estérases nécessitent donc l'action préalable d'endoxylanases afin d'obtenir une diminution de la taille du substrat. L'action des endoxylanases interviendraient dans des régions faiblement acétylées libérant des xylo-oligossacharides acétylés qui seront alors des substrats des acétyle estérases. Ce type d'enzyme associé à une endoxylanase conduit parfois à une action
synergique (Blum et al. 1999).
-Les féruloyle estérases (EC 3.1.12)
Elles sont capables de libérer l'acide férulique estérifié à l'arabinose ramifiant les arabinoxylanes. Comme la plupart des enzymes accessoires de la dégradation des arabinoxylanes, les féruloyles estérases agissent préférentiellement sur des substrats de petite taille (oligomère) (Mac Kenzie et Bilous 1988), mais peuvent parfois agir sur des substrats polymériques (Tenkanen et al. 1991, Bartolomé et al. 1997). Récemment, il a été montré qu'en combinaison avec des xylanases provenant de familles et de microorganismes différents, les féruloyles estérases pouvaient solubiliser des taux variables d'acides féruliques pariétaux (Faulds et al. 2003)
Les sons de blé sont des co-produits de la transformation des grains de blé en farines et semoules. Fraction technologique de la mouture des grains, ils sont constitués des enveloppes du grain, ainsi que d'une couche de cellule provenant de l'albumen amylacé de ces fruits qui ne s'ouvrent pas à maturité (indéhiscents). Les sons constituant 15 à 20% de la masse du grain, et la production mondiale en blé avoisinant le milliard de tonnes par an, la transformation de cette céréale génère par conséquent des quantités considérables de ces co-produits.
Leur valorisation énergétique et financière est actuellement incomplète. Aujourd'hui, elle s'appuie essentiellement sur deux stratégies. La première utilise le son en tant que produit alimentaire, principalement destiné à l'alimentation animale en raison de son potentiel nutritionnel important (fibres et micronutriments). La deuxième stratégie repose sur l'extraction des composés constitutifs du son avant transformation pour des utilisations multiples en industrie agroalimentaire ou non alimentaire.
La région Champagne–Ardenne est un site de production du blé de tout premier ordre au niveau européen, produisant surtout des farines panifiables issues de blé «tendre» Triticum aestivum. En raison de la réduction des marges bénéficiaires, la valorisation des co-produits
que sont les pailles et les sons est devenue une nécessité économique impérieuse. Cette étude s'inscrit dans ce contexte, auquel s'ajoute la prise en compte de transformations «non-polluantes», exigence sociale fortement exprimée depuis les dernières décennies. Au moins une partie du développement des biotechnologies en découle, les techniques chimiques dites polluantes utilisées jusqu'ici sont contraintes de chercher des substitutions plus
«respectueuses» de l'environnement. Le laboratoire où j'ai effectué ces travaux travaille à l'élaboration de stratégies de bioconversion enzymatique de la biomasse, en particulier la dégradation enzymatique des sons de blé, Triticum aestivum. Ce cadre général a guidé mes travaux, co-financés par la Région Champagne–Ardenne et l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA).
Les objectifs majeurs de ces travaux sont la compréhension/amélioration de la dégradation des arabinoxylanes des sons de blé tendre par des endoxylanases. Une clé essentielle requise pour la bioconversion rationnelle du végétal est de mieux cerner les limitations de l'hydrolyse enzymatique et la disponibilité physicochimique des substrats. Paradoxalement, ces
limitations résultent de la richesse et de la diversité des interactions entre constituants pariétaux, ceux là même que l'on tente de valoriser.
Les recherches effectuées dans le cadre de ce projet s'appuient sur de précédents travaux (Benamrouche-Stitou, 2002), où les bases chimiques et histologiques de la dégradation des sons par une endoxylanase ont été établies. La démarche entreprise ici se situe essentiellement sur un plan cognitif, portant à la fois sur l'état des composés pariétaux natifs, puis post-hydrolytiques et leurs rendements de solubilisation. Les paramètres d'accessibilité des enzymes aux substrats dans les différents types de parois des sons matures ou lors du développement du grain ont été considérés. Afin de mieux maîtriser les applications pouvant résulter du désassemblage des composés pariétaux des sons, l'analyse biochimique des
composants connus comme influençant l'organisation des parois, et par conséquent l'action des enzymes a été suivie au cours de la maturation des parois. Cette stratégie visait à définir temporellement certaines des limitations vis à vis de l'hydrolyse enzymatique.
Cette étude repose sur une approche multi disciplinaire où microscopie et biochimie se côtoient. La complémentarité des techniques mises en oeuvre permet d'explorer plusieurs niveaux d'organisation: histologique, cytologique et moléculaire.
L'architecture de ce manuscrit est organisée en quatre chapitres qui comportent chacun une introduction, le matériel et méthode, les résultats, la discussion ainsi que les références bibliographiques. Cette présentation repose sur un découpage des travaux en cinq articles scientifiques soumis pour publication dans des revues internationales à comité de lecture. Les principaux résultats sont regroupés et commentés dans une discussion générale, incluant les perspectives possibles à ce travail. Enfin, l'ensemble des références bibliographiques utilisées
sont regroupées à la fin de ce mémoire.
Chapitre I Relations entre variabilité biochimique des sons industriels - dégradabilité à