A.Révélation ECL. Les bandes présentent un aspect en haltère très hétérogène. B.Révélation FLUO. Les bandes présentent un aspect plus homogène qu’en ECL.
Echantillons CV% - ECL CV% - FLUO
2531 36,59 6,96
2533 26,22 9,29
2544 31,23 31,16
2548 36,74 9,11
2555 34,62 11,22
2556 8,09 39,88
2567 89,4 7,25
2576 30 11,68
2582 31,83 10,81
2585 34,25 7,59
2587 58,34 1,17
2588 29,04 11,13
2594 47,41 15,1
2597 51,63 0,97
2604 84,41 12,56
Moyenne des CV% 41,99 12,39
Tableau 12. Coefficients de Variation en % pour différents échantillons en ECL et
FLUO lors d’une quantification par Western-Blot sur Hsp27
Résultats et Discussion
82 milieu. Afin de calculer le Cœfficient de Variation (CV) technique en % pour chaque échantillon, deux réplicats sont quantifiés par des Western-Blot / ECL différents. La quantification par Western-Blot / ECL de la protéine Hsp27 a été réalisée sur 15 échantillons du programme MUGENE-2003. Les CV% obtenus (Tableau 12) étaient très élevés, présentant une moyenne de 41,99 % sur les 15 échantillons analysés. Certains échantillons présentaient même un CV technique supérieur à 80 %. Cette variation technique s’explique en partie par l’aspect hétérogène des bandes, qui a tendance à fausser le calcul de l’intensité totale de cette dernière par le logiciel d’analyse d’image. Une autre raison provient du système ECL en lui-même : en effet, il s’agit d’une détection très indirecte avec une succession importante d’étape après la fixation de l’anticorps secondaire sur le primaire : la quantité de substrat disponible pour la péroxidase de l’anticorps, l’efficacité de la réaction catalysée par cette dernière, l’émission de photons par le produit, l’impact de ces derniers sur le film photosensible, et enfin la conversion du film en image par un scanner. Le système de révélation ECL, tel qu’il est effectué au laboratoire, était donc inadapté pour des quantifications à grande échelle dans le but de valider des protéines comme marqueur. De plus, la faible sensibilité de la technique, due au film photosensible, rendait difficile (et coûteuse en terme d’anticorps et d’échantillons) la détection de protéines peu abondantes (telles que Hsp40 ou les Hsp70).
Une autre méthode de révélation de l’anticorps primaire devenait donc nécessaire. La technique de révélation par l’utilisation d’anticorps secondaires fluorescents représente une bonne alternative par rapport à l’ECL car elle comporte moins d’étapes, et donc moins de facteur de variabilité. Des comparaisons entre des Western-Blot ECL et Fluorescence (FLUO) ont été effectuées, avec la protéine Hsp27 et sur les 15 échantillons du programme MUGENE-2003 évoqués précédemment, avec deux réplicats provenant de deux Western-Blot différents. Le premier résultat est l’aspect des bandes obtenues (Figure 36B). En effet, ces bandes présentent un aspect homogène, beaucoup plus qu’en ECL, ce qui était de bonne augure pour les quantifications. De manière plus générale, les membranes n’ont presque pas de taches parasites, comme il est courant d’en avoir avec la révélation ECL. Par la suite, les quantifications effectuées ont montré des CV techniques en moyenne 3,5 fois plus faibles qu’en ECL, avec une moyenne de 12,39 % sur les 15 échantillons étudiés contre 41,99 % en ECL (Tableau 12). La raison de cette fiabilité technique est le caractère direct de la révélation. En effet, à partir de la fixation de l’anticorps secondaire sur le primaire, le fluorochrome fixé à l’anticorps émet, après excitation par un laser à 778 nm, un signal fluorescent à 795 nm. C’est l’intensité de ce signal qui est directement quantifiée. Cette grande répétabilité fait de la
Résultats et Discussion
83 révélation par fluorescence une technique de choix pour les quantifications envisagées. De plus, le scanner utilisé pour la fluorescence possède un spectre de détection beaucoup plus large que le film photosensible, ce qui permet de détecter les faibles signaux provenant de protéines peu abondantes.
Cette différence de variabilité technique entre ECL et FLUO est à relativiser selon le différentiel de moyens techniques employés. En effet, la révélation ECL, telle qu’elle est réalisée au laboratoire, utilise un film photosensible. Tandis que la révélation FLUO utilise un scanner à fluorescence. Il s’agit d’un scanner « dernière génération » et par conséquent, beaucoup plus performant qu’une plaque photosensible. En utilisant un détecteur de chémiluminescence de dernière génération, les variations techniques obtenues avec le système ECL devraient être moindres. Cependant, la différence de successions d’étapes entre les deux techniques restant inchangée, le système FLUO demeure le plus fiable des deux (la FLUO ayant moins d’étapes que l’ECL).
Au regard des résultats obtenus lors de la comparaison des révélations ECL et FLUO, la révélation d’anticorps primaires par fluorescence a été adoptée pour les expérimentations. Ce choix entre ECL et FLUO a fait l’objet d’un poster et d’une
présentation orale aux 12èmes Journées Sciences du Muscle et Technologies des Viandes.
I.2.2 Validations de la spécificité des anticorps primaires
A partir de la liste des 41 protéines considérés comme marqueurs potentiels de la tendreté, 49 anticorps ont été testés pour leur spécificité par Western-Blot, pour en retenir au final 24 (Tableau 13). Par exemple, un Western-Blot avec l’anticorps anti-Hsp70-1A/B (Figure 37A) a montré que cet anticorps est spécifique, par la détection d’une bande unique de taille attendue. Au contraire, les Western-Blot effectués sur l’actine- (Figure 37B) et la S100-A1 (Figure 37C) ont invalidé l’utilisation de ces anticorps, à cause d’une absence de reconnaissance et d’une fixation aspécifique respectivement. Ces validations ont permis d’optimiser les conditions d’utilisation et les dilutions optimales pour chacun de 24 des anticorps (Tableau 14). Ces 24 anticorps fonctionnels ont permis de sélectionner les 24 protéines à quantifier et à étudier au cours de la thèse.
Marqueur protéique Anticorps testé Validation
Actine- Beta-actin Non retenu
Acyl-CoA desaturase SCD Non retenu Acyl-coenzyme A thioesterase 2 ACOT2 Non retenu ATP synthse Chaîne B ATP5B Non retenu Calpastatine Calpastatine Non retenu
CapZ CAPZB Retenu
Caspase 3 CASP3 (Acris) Non retenu Caspase 3 (INRA) Non retenu CASP3 (Interchim) Non retenu Caspase 8 CASP8 (Acris) Non retenu CASP8 (Interchim) Non retenu
Cis-Peroxiredoxine PRX6 Non retenu
PRDX6 Retenu
Crystalline Chaîne B CRYAB Retenu
Desmine Desmine Retenu
Diacylglycerol O-acyltransferase DGAT2 Non retenu
DJ-1 PARK7 Retenu
Enolase 1 ENO1 (Abnova) Non retenu
ENO1 (Acris) Retenu
Enolase 3 ENO3 Retenu
Hsp20 Hsp20 Retenu
Hsp27 Hsp27 Retenu
Hsp40 Hsp40-4 KA Non retenu
Hsp40-4 SPM Retenu
Hsp60 Hsp60 Non retenu
Hsp70-1A/B HSPA1B Retenu
Hsp70-8 HSP70 BRM22 Retenu
Hsp70-Grp75 Hsp70/GRP75 Retenu
Lactate Deshydrogenase Chaîne B LDHB Retenu
Malate Deshydrogenase 1 (cytoplasmique) MDH1 Retenu
Malate Deshydrogenase 2 (mitochondriale) MDH2 Non retenu
M-calpaïne M-calpain Retenu
Mu-calpaïne μ-calpain Retenu
Myosin Binding Protein H MYPBH Retenu
Myosin Heavy Chain I (slow) MYH1 Retenu
Myosin Heavy Chain II (fast) MyHC-IIa Retenu
MyHC-IIa+x Retenu
Myosin Light Chain 1F MYL1 Retenu
Myosin Regulatory Light Chain 2 MLC2 Non retenu
NADH NADH Non retenu
Phosphoglucomutase PGM1 Retenu
S100-A1 S100-A1 Non retenu
Super-oxyde Dismutase Cu/Zn SOD1 (Santacruz) Non retenu
SOD1 (Acris) Retenu
Super-oxyde Dismutase Mitochondriale SOD3 Non retenu Triose Phosphate Isomerase Triose P Isomerase Non retenu
Tropomyosine 3 TPM3 Non retenu
Troponine T1 TNNT1 Non retenu
Troponine T3 TNNT3 Non retenu
97 kDa 66 kDa 45 kDa 27 kDa 20 kDa 14 kDa 6 kDa
Hsp70-1A/B : taille attendue = 70,22 kDa : validation
Actine-: taille attendue = 41,73 kDa : invalidation
B E
Echantillons de muscle Echantillons de muscle
97 kDa 66 kDa 45 kDa 27 kDa 20 kDa 14 kDa 6 kDa 97 kDa 66 kDa 45 kDa 27 kDa 20 kDa 14 kDa 6 kDa B E
Echantillons de muscle Echantillons de muscle
B E
Echantillons de muscle Echantillons de muscle
A
B
S100-A1 : taille attendue = 10,55 kDa : invalidation
C
Figure 37. Exemples de validation / invalidation d’anticorps primaires
B : Blanc
Nom AC Forme Dilution Conditions 2ème Anticorps Dilution Conditions
CAPZB Monoclonale 1/250 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C Crystallin B Monoclonale 1/500 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C Desmine Monoclonale 1/250 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C DJ-1 Polyclonale 1/250 1 heure 30 à 37°C Anti Rabbit LICOR 1/20000 30' 37°C Eno1 Polyclonale 1/2000 1 heure 30 37°C Anti Rabbit LICOR 1/20000 30' 37°C Eno3 Monoclonale 1/45000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C Hsp20 Monoclonale 1/200 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C HSP27 Monoclonale 1/3000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C HSP40-4 Monoclonale 1/250 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C HSP70 (HSPA8) Monoclonale 1/250 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C HSP70/GRP75 Monoclonale 1/250 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C HSPA1B (Hsp70prot1B) Monoclonale 1/2000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C LDHB Monoclonale 1/50000 1 heure 30 37°C Anti Rabbit LICOR 1/20000 30' 37°C M-calpaïne Monoclonale 1/1000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C MDH1 cytoplasmique Monoclonale 1/1000 1 heure 30 à 37°C Anti Sheep LICOR 1/20000 30' 37°C MyBP-H Monoclonale 1/4000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C MYL1 Polyclonale 1/1000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C Myosine IIx 8F4 Monoclonale 1/500 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C Myosine lente 5B9 Monoclonale 1/2000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C Myosine rapide 15F4 Monoclonale 1/4000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C PGM1 Monoclonale 1/8000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C PRDX6 Monoclonale 1/500 1 heure 30 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C SOD1 Polyclonale 1/1000 1 heure 30 37°C Anti Rabbit LICOR 1/20000 30' 37°C μ-calpaïne Monoclonale 1/1000 1 heure 30 à 37°C Anti Mouse LICOR 1/20000 30' 37°C
Résultats et Discussion
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I.2.3 Mise au point du Dot-Blot de quantification de protéines
Un aspect limitant s’est vite imposé lors de la quantification par Western-Blot d’une trentaine de protéines sur plus de 100 échantillons différents : la durée. En effet, réaliser de telles quantifications, avec 3 ou 4 réplicats par échantillon, auraient pris plus de 3 années complètes entièrement consacrées aux Western-Blot. L’ELISA ne représentant pas une solution alternative adaptable à toutes les protéines étudiées, une autre technique a été recherchée, adaptable à toutes les protéines étudiées, aussi fiable que le Western-Blot, mais plus rapide. Une alternative au Western-Blot est le Dot-Blot, technique couramment utilisée pour étudier les ARN, et qui présente des caractéristiques proches d’une puce à ARN. Nous avons cherché des références bibliographiques utilisant et validant cette technique dans le cadre de quantifications de protéines. Dans le même temps, divers tests ont été entrepris afin de savoir si cette technique était réalisable avec le matériel de Western-Blot à disposition. Les résultats favorables ont donc encouragé à utiliser le Dot-Blot. Cependant, aucune référence bibliographique validant une technique de Dot-Blot pour quantifier des protéines n’avait été trouvée. Nous avons donc mis au point et validé un protocole de Dot-Blot dans ce sens, en utilisant la révélation par fluorescence. La technique a été présentée pour la première fois à l’International Symposium for Young Scientists, suite à quoi elle a fait l’objet d’une publication dans le Journal of Physiology pour quantifier des protéines.
Résultats et Discussion
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