Figure 34 : Analyse par Western blot de l'expression de TSAP6 dans le foie

Ce résultat est confirmé par immunohistochimie sur des coupes de foie, bien que cette technique soit moins sensible et peu quantitative.

W T 64 51 39 28 191 W T M u ta n t M u ta n t TSAP6 native TSAP6 glycosyl ée indéterminé (cf. VI.I.I)

PCNA (contrôle équilibre)

191 64 51 39 W T W T M u ta n t M u ta n t TSAP6 native TSAP6 glycosyl ée indéterminé (cf. VI.I.I)

Des expériences d'immunofluorescence sur des hépatocytes primaires isolés des souris WT et mutantes ont permis de montrer qu'aucune différence de localisation intracellulaire de TSAP6 n'est induite par la mutation.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si la mutation de TSAP6 pouvait affecter la sécrétion de l'α1-antitrypsine. Pour cela, nous avons analysé l'expression de cette protéine dans le foie et les poumons par Western blot ; si aucune différence d'expression n'a pu être

mise en évidence dans les poumons, il semble que le foie des souris mâles mutantes (mais pas des femelles) contienne plus d'α1-antitrypsine que dans les souris mâles sauvages (résultats non présentés). Ceci pourrait être cohérent avec un déficit de sécrétion puisque l'on retrouve plus de protéine dans le lysat cellulaire.

La sécrétion de cette antiprotéase par des cellules MEFs sauvages et mutantes à été comparée. Elle n'a révélé aucune différence significative.

Comme nous l'avons vu, une des fonctions de TSAP6 est de s'associer à TCTP et surtout d'induire sa sécrétion (Amzallag et al., 2004). Or, il a été montré que TCTP est surexprimé dans les poumons de personnes souffrant d'emphysème par rapport à des personnes non (ou faiblement) atteintes (Spira et al., 2004). De plus, TCTP a été décrit comme pouvant à son tour induire la sécrétion de l'IL-13 ; or celle-ci voit son expression nettement diminuée chez des patients présentant certains types d'emphysème (Boutten et al., 2004).

Nous avons donc analysé l'expression de la protéine TCTP dans les poumons et le foie des souris sauvages et mutantes ainsi que son niveau de sécrétion les hépatocytes et cellules MEFs.

Les études préliminaires ne montrent pas de différence significative d'expression de TCTP dans les foies ni les poumons entre les souris WT et mutantes. D'autre part, l'analyse de la sécrétion de TCTP dans des cellules MEFs issues d'embryons WT et mutants a montré ,dans certains clones, une augmentation de la sécrétion de TCTP par rapports aux clones sauvages (résultats non présentés). De la même façon, lors de l'analyse de la sécrétion de TCTP par des hépatocytes primaires, nous avons détecté une sécrétion accrue de TCTP dans certains des hépatocytes mutants (résultats non présentés).

Il est à noter que le phénotype emphysémateux n'a pas été trouvé dans 100% des souris mutantes, il est possible que la sécrétion de TCTP ne soit pas affectée dans tous les clones (MEFs ou hépatocytes). Il conviendrait de répéter ces expériences sur un plus grand nombre d'échantillons, de manière à obtenir des résultats statistiquement interprétables quant à l'effet de la mutation de TSAP6 sur la sécrétion de TCTP.

VII.1.5 - Perspectives

VII.1.5.1 - Une piste pour expliquer le phénotype sanguin

Parmi les partenaires de TSAP6 identifiés par notre laboratoire se trouve Nix (Passer et al., 2003). Or l'expression de l'ARNm nix augmente lors de la maturation des précurseurs

érythrocytaires suite à un traitement par le facteur de croissance érythropoïétique: l'érythropoïétine (Aerbajinai et al., 2003).

Par conséquent, il sera intéressant d'étudier le niveau d'expression de Nix dans les cellules sanguines ainsi que son interaction avec TSAP6 et de voir si un déficit de la quantité ou de la fonction de Nix peut entraîner un défaut d'érythropoïèse conduisant aux phénotypes de microcytose et d'érythrocytose.

VII.1.5.2 - Plusieurs pistes pour expliquer l'emphysème pulmonaire

Nous prévoyons de confirmer les différences d'expression des protéines TSAP6, TCTP et α1-antitrypsine observées dans les poumons et les foies en analysant un plus grand nombre de souris.

Si la baisse du niveau de TSAP6 est confirmée dans différents organes, nous tenterons de déterminer si la mutation affecte la demi-vie de la protéine.

De la même façon que TCTP, un autre partenaire de TSAP6, Nix, a été retrouvé surexprimé dans les poumons de patients emphysémateux (Spira et al., 2004). Nix et TSAP6 coopèrent pour induire l'apoptose (Passer et al., 2003). Or différents modèles d'emphysème montrent une apoptose accrue au niveau des poumons. Il nous faudra donc vérifier le niveau d'expression de Nix dans les poumons des souris mutantes.

Pour TCTP comme pour Nix, des études sont en cours de façon à vérifier si la mutation n'affecte pas leur interaction avec TSAP6.

Différentes hypothèses peuvent permettre d'expliquer l'apparition de l'emphysème dans les souris mutantes. La mutation Gln

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Nous pensons que, comme cela a été décrit pour d'autres modèles d'emphysème, le phénotype que nous observons pourrait être dû à une augmentation du processus apoptotique. La mutation induirait donc un "gain de fonction" pour l'activité pro-apoptotique de TSAP6.

Si la mutation de TSAP6 induit une augmentation de la fonction pro-apoptotique de Nix, de la capacité de TSAP6 à sécréter la protéine anti-apoptotique TCTP, l'accroissement de l'apoptose apparaît comme une conséquence logique de cette mutation.

VII.1.5.3 - Corrélations entre les phénotypes

La mutation de TSAP6 a des effets à la fois sur la taille et le nombre des globules rouges. Mais l'un des deux phénotypes sanguins ne pourrait-il pas être la conséquence de

En effet, on sait que, d'une façon générale, il est nécessaire que la quantité d'oxygène transporté par le sang reste identique pour éviter une anémie. Cette quantité est relative à la quantité d'hémoglobine dans les cellules puisque c'est elle qui transporte l'oxygène.

On pourrait imaginer que la mutation ne perturbe que la taille des globules rouges et pas directement leur nombre. Afin de compenser le manque en oxygène (dû au fait que les cellules des souris mutantes sont plus petites, et contiennent moins d'hémoglobine), l'organisme produirait les érythrocytes en plus grand nombre. L'enchaînement inverse est également envisageable. Ces hypothèses restent à être vérifiées.

En outre, on peut émettre l'hypothèse que le phénotype au niveau des cellules sanguines ne serait qu'une conséquence du phénotype pulmonaire. En effet, on sait que l'emphysème entraîne une perturbation de la fonction pulmonaire d'absorption de l'oxygène. Or, il a été décrit qu'il existe une corrélation entre la quantité de globules rouges et la concentration en oxygène dans le sang (Vanier et al., 1963), et qu'une hypoxémie (faible quantité d'oxygène dans le sang) pouvait entraîner une polycythémie (Cournand, 1950). De plus, l'administration d'oxygène à des patients hypoxiques permet de rétablir un hématocrite et un volume des globules rouges normal (Chamberlain and Millard, 1963).

En accord avec cette hypothèse, plusieurs articles décrivent que dans de rares cas l'emphysème peut entraîner diverses complications dont une érythrocytose (Freedman and Penington, 1963; Herbert et al., 1964; Segel and Bishop, 1966).

Mais, comme les souris TSAP6 mutantes présentent un hématocrite normal (puisque la microcytose compense l'érythrocytose), ce phénomène de correction ne semble pas pouvoir expliquer leur phénotype sanguin.

Enfin, nous avons pu trouver dans la littérature qu'un type particulier de facteur de transcription est impliqué à la fois dans des mécanismes de l'érythropoïèse et dans l'emphysème.

Les facteurs de transcription Nf-E2 et NrF2 (Nfe2l2 nuclear factor erythroid derived 2, like 2) sont des protéines très similaires qui induisent l'expression de gènes impliqués dans

l'érythropoïèse dont celui codant la

β

de l'oxygène par les érythrocytes (Ney et al., 1990; Moi et al., 1994; Kotkow and Orkin, 1995).

Il est important de noter que NrF2 protège les souris contre l'apparition de l'emphysème suite à l'exposition à la fumée de cigarette (Rangasamy et al., 2004) et qu'en plus une mutation Val-173-Ala de Nf-E2 est corrélée avec l'apparition d'une microcytose (Peters et al., 1993).

En outre, l'hémine peut participer à l'induction de ces facteurs de transcription. Or, c'est un produit d'oxydation de l'hème (qui a été supposé pouvoir se lier à TSAP6 (Sanchez-Pulido et al., 2004)) et, comme nous avons montré plus haut, elle peut jouer sur l'oligomérisation de la protéine TSAP6 (VI.1.3 - page 83).

hybride réalisé dans le but d'identifier les partenaires de TSAP6 a révélé AKR1B3 comme pouvant être un ligand potentiel (résultats non publiés). Enfin, différents ARNm codants pour des aldo-keto reductases ont été trouvé surexprimés dans les souris exposées à la fumée de cigarette et chez des fumeurs atteints d'emphysème (Hackett et al., 2003; Rangasamy et al., 2004).

Les phénotypes sanguins et pulmonaires semblent pouvoir être liés au niveau moléculaire puisque plusieurs protéines pourraient avoir des rôles à la fois dans les mécanismes d'érythropoïèse et d'emphysème. De plus l'hémine, qui est un ligand potentiel de TSAP6, semblerait avoir un rôle central permettant de relier TSAP6, NrF2/NfE2, AKR1B3 et les phénotypes.

L'effet de la mutation de tsap6 sur son interaction avec AKR1B3 ou l'hémine, et sur la fonction de Nrf2 sont donc des voies que nous devrons explorer pour tenter d'expliquer et éventuellement de corréler les deux phénotypes.

Une étude approfondie de ces souris nous permettra peut-être de détecter de nouveaux phénotypes dus à la mutation de tsap6, et ainsi d'investiguer de nouvelles fonctions de la protéine.

Nous savons déjà que les croisements entre souris hétérozygotes engendrent des souris dont la répartition génotypique ne suit pas les lois de Mendel. Il est intéressant de noter que cette même observation a été faite dans les souris KO pour l'isoforme PI2 de l'

αααα

En raison de la nature de la mutation par rapport au consensus ACRATA et des fonctions prédites pour TSAP6. Il sera important de vérifier si TSAP6 est capable de lier l'hème et d'avoir une activité oxydo-reductase et il faudra déterminer si ces fonctions sont altérées par la mutation.