religation par la voie de réparation du « Non-Homologous End-Joining », après transfection dans des fibroblastes de contrôle, du patient, et d’un individu muté Cernunnos. La taille des
délétions est répertoriée (a). Le pourcentage de jonctions avec micro-homologies est également quantifié (b).
• L’absence de déubiquitination de l’histone H2A mono-ubiquitinée dans la région endommagée pourrait engendrer un état constitutif d’ « hyper-signalisation »
La mutation située dans le cœur catalytique de MYSM1 conduit très vraisemblablement à une perte de fonction, et donc de son activité de déubiquitination de l’histone H2A : de ce fait, on peut considérer qu’il y a un état d’ « hyper-mono-ubiquitination » de l’histone H2A (similaire à une activation constitutive). Cela serait un signal permanent transmis à la cellule pour l’activation de la signalisation de réponse aux dommages de l’ADN. Cette situation de stress cellulaire, due à une signalisation inappropriée, serait dommageable à la cellule lorsque de réels dommages de l’ADN interviennent, puisque les acteurs de la réparation seraient déjà mobilisés inutilement, aléatoirement dans la cellule. Pour étudier cette hypothèse, nous comparerons par FRAP (« Fluorescence Recovery After Photobleaching ») la mobilité de certains facteurs de réparation de l’ADN dans des fibroblastes contrôles et du patient. De même, on pourrait suivre l’évolution de l’état d’ubiquitination et de déubiquitination de l’histone H2A au cours de cinétique post-cassures double brin, par immunofluorescence.
• L’exploration du modèle murin KO conditionnel pour Mysm1 devrait permettre de préciser les fonctions de Mysm1
Le modèle murin KO conditionnel est en cours de production dans le laboratoire à partir de cellules ES provenant du consortium KOMP (« Knock-Out Mouse Project »). Dès obtention de ces souris, il nous sera envisageable de développer des lignées de fibroblastes d’oreille et en parallèle des MEFs de souris déficientes en Mysm1. Le but sera d’explorer et de reproduire les approches expérimentales permettant l’analyse de la réponse aux lésions de l’ADN (mesure de la sensibilité aux drogues génotoxiques, de l’accumulation des cellules en transition G2 / M, et vérification de l’intégrité de la signalisation Fanconi). Des analogies entre modèle humain et murin sont attendues pour ce qui est de la réparation de l’ADN, étant donné les défauts immuno-hématologiques très semblables entre les 2 modèles. A plus long
terme, nous aimerions utiliser ce modèle souris pour explorer le versant immunitaire, et estimer l’importance de MYSM1 au cours des processus de recombinaison V(D)J, de la commutation de classe des immunoglobulines. Puisque les souris KO Mysm1 n’ont pas de lymphocytes B, les explorations seront possibles en délétant Mysm1 spécifiquement dans les lymphocytes B (en croisant nos souris conditionnelles avec des CD21-Cre exprimant la recombinase Cre.
• Le rôle transcriptionnel de MYSM1 serait indépendant de son action aux dommages De plus, en se référant aux fonctions de MYSM1 déjà exposées dans la littérature et pour pouvoir conclure sur un rôle direct ou indirect au cours de la réparation, des approches d’inhibition transcriptionnelle ont déjà été initiées. L’utilisation d’inhibiteur tel que l’actinomycine D, suivi d’une validation de l’efficacité de l’extinction par des vecteurs d’expression de la luciférase avec le gène rapporteur T4 Renilla, permettront de valider l’approche. La mise en présence des cellules transcriptionnellement inactives à des traitements génotoxiques générant des cassures double brin ou des ponts inter-brins permettront de conclure définitivement, si le phénotype de défaut de réparation des ponts inter-brin ou des cassures double brin est une conséquence primaire ou secondaire à des dérégulations transcriptionnelles de certains facteurs sous contrôle de MYSM1 (sachant que nous ne concluons pas en une dérégulation de gènes impliqués dans la réparation chez le patient, par notre approche de puce Affymetrix). Enfin, nous entreprenons actuellement le développement de cellules IPS (« Induced Pluripotent Stem cells ») à partir des fibroblastes primaires du patient, en collaboration avec Luigi D. NOTARANGELO (Harvard University, Etats-Unis), pour avoir un modèle de différentiation in-vitro de cellules du système immuno- hématopoïétique humain. Nous pourrons ainsi procéder à des analyses transcriptomiques au cours de ces étapes de différenciation.
• Certaines caractéristiques phénotypiques dans les modèles déficients, pourraient mettre en évidence la participation de MYSM1 à d’autres processus
Outre le système immuno-hématologique, si l’on compare le modèle souris et le patient, on s’aperçoit de certains traits relevés comme l’absence de queue, qui ne peuvent pas être la conséquence des dysfonctions du système immunitaire. Ceci est compatible avec les aberrations de développement relevé de certains organes (surdité, atrésie des choanes et microcéphalie). Procéder à ces analyses phénotypiques comparatives pourraient permettre de conclure que MYSM1 participe à d’autres processus. Ainsi, l’activité de régulateur transcriptionnel de MYSM1, comme le suggère l’étude de P. Zhu, ciblerait également certains facteurs clés impliqués au cours du développement embryonnaire.
• L’influence de MYSM1 sur le déroulement du cycle cellulaire
Nous avons remarqué que les cultures issues des fibroblastes primaires du patient ainsi que ceux transformés par le virus SV40 ou télomérisés par hTERT, ont des capacités prolifératives plus importantes (temps de doublement réduit), comparé à des contrôles. Nous avons d’ores et déjà entrepris des études de synchronisation cellulaire, par double blocage thymidine (accumulant les cellules en fin de phase G1 ou phase S précoce), ou par blocage thymidine – colcémide (accumulant les cellules en fin de phase S - début mitose), puis relâchement afin de suivre la cinétique de redémarrage du cycle cellulaire. Des résultats très préliminaires (données non présentées) suggèrent que les cellules déficientes en MYSM1 ont une progression plus rapide au cours du cycle cellulaire après la synchronisation. On peut imaginer que MYSM1 pourrait avoir une action sur l’un des points de contrôle du cycle cellulaire. Pourtant, les proliférations mesurées par incorporation de BrDU et par l’iodure de propidium semblent comparables aux contrôles. De ce fait, l’étude des fourches de réplication par peignage moléculaire pourrait nous apporter certains éléments de compréhension.
• MYSM1 est-il un acteur aux télomères ?
Les analyses phénotypiques classiques que nous réalisons au laboratoire ont révélé certaines caractéristiques particulières chez le patient muté dans le gène MYSM1. La taille des télomères à partir de l’ADN génomique de sang total ou de fibroblastes primaires a été estimée. Les TIFs, les anomalies par FISH et co-FISH ainsi que la sénescence ont été explorées et quantifiées. Ces explorations préliminaires nous ont interpellés (figure 70, 71, 72 et 73). En effet, bien que les télomères soient de tailles normales (9,6 kb) comparativement aux parents, et à son frère et cousin sains, nous avons relevé un fort taux de senescence (près de 70 %). De plus, aucune aberration télomérique n’apparaît significative, mais la colocalisation de 53BP1 avec une sonde télomérique (TIFs) est très significativement augmentée dans les cellules du patient. Ceci suggère d’éventuelles anomalies aux télomères.