Ferlines

L'otoferline appartient à la famille protéique des ferlines, composée chez l'humain, de cinq membres en plus de l'otoferline (fer1L2) : la dysferline (fer1L1), la myoferline (fer1L3), fer1L4, fer1L5 et fer1L6 (Lek et al., 2010). La première ferline identifiée a été Fer-1, dans Caenorhabditis elegans. Fer-1 est un facteur de fécondation requis pour la fusion de vésicules spécialisées (organelles membranaires) avec la membrane plasmique durant la spermatogénèse (Achanzar and Ward, 1997). Les caractéristiques principales des ferlines sont : la présence de multiples domaines C2 qui partagent une forte similarité de séquence, la présence de domaines "Fer", leur ancrage membranaire par leur domaine C-terminal et leur implication dans les évènements de fusion membranaire (McNeil and Kirchhausen, 2005; Jiménez and Bashir, 2007; Lek et al., 2012). Seuls les rôles physiologiques de la dysferline et la myoferline seront discutés dans ce manuscrit.

Chapitre 4 Otoferline Introduction

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a) Myoferline :

La myoferline est exprimée de façon ubiquitaire avec une expression plus importante dans les muscles cardiaques et squelettiques et dans le placenta (Davis et al., 2000). La myoferline est impliquée dans la fusion des myoblastes, dans la réparation et la régénération mais aussi dans le développement des membranes des cellules musculaires en général (Doherty et al., 2005). La myoferline contient sept domaines C2 exprimant, contrairement à l'otoferline, le domaine C2-DE, qui se situe entre le domaine C2-D et C2-E (Lek et al., 2010). Un domaine dysferline (DysF), se constituant de deux longs feuillets β, est retrouvé entre les domaines C2-C et C2D et un domaine FerA, constitué de hélices α, précède le domaine FerB (Fig.12). Bien que leurs rôles soient encore inconnus, le domaine FerA semble être présent de façon concomitante avec le domaine DysF dans la famille des Ferlines, suggérant une relation fonctionnelle entre ces deux domaines.

Figure 12 : Représentation schématique de la structure de l'otoferline, la myoferline et la dysferline. Ces protéines de la famille des Ferlines sont constituées de domaines C2, des domaines

FerI et FerB ainsi que d'un domaine transmembranaire (TM) en C-terminal. Un domaine nommé dysferline (DysF) se situe entre les domaines C2-C et C2-D et un domaine FerA précède le domaine FerB chez la myoferline et la dysferline.

b) Dysferline :

La dysferline est également exprimée de façon ubiquitaire avec une forte expression dans le cerveau, le cœur et les muscles squelettiques (Anderson et al., 1999). De façon similaire à la myoferline, la dysferline se compose de sept domaines C2, du domaine DysF et du domaine FerA précédant le domaine FerB (Fig.12). Les mutations répertoriées sur la dysferline entrainent des "dysferlinopathies" incluant des dystrophies musculaires qui se traduisent par déclin physique important (Bashir et al., 1998; Liu et al., 1998). Un modèle murin déficient pour la dysferline révèle son action comme premier régulateur d'urgence de la réparation membranaire de façon calcium- dépendante suite à une lésion membranaire des myofibres (Bansal et al., 2003; voir revue : Barthélémy et al., 2018).

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Une étude de Lek et al. (2013) démontre que la dysferline peut être clivée par la calpaïne (1 et 2; protéase dépendante du calcium) en réponse à un influx calcique suivant une lésion membranaire. Le clivage de la dysferline par la calpaïne libère un fragment C-terminal de ~72 kDa, appelé "mini- dysferline-C72", comportant les deux derniers domaines C2 en C-terminal (C2-E et C2-F) et le domaine TM. Comme les anticorps dirigés contre la partie N-terminal ne détectent aucune dysferline aux sites de lésions contrairement aux anticorps dirigés contre la partie C-terminal, les auteurs déterminent que la mini-dysferline-C72 est recrutée de façon sélective, où elle aurait un rôle de réparation membranaire (Lek et al., 2013; Redpath et al., 2014).

Il est intéressant de noter que l'expression d'une mini-dysferline, constituée uniquement des deux derniers domaines en C-terminal ainsi que du domaine TM, dans les cellules musculaires via l'utilisation d'un vecteur AAV, a permis une réparation efficace des sites de lésions dans un modèle murin de dysferlinopathie (Krahn et al., 2010). Les auteurs suggèrent alors que ce motif à deux domaines C2 constitue une configuration minimale requise pour la fonction physiologique de la dysferline de réparation membranaire

L'otoferline et la myoferline peuvent elles aussi libérer un module comportant les deux derniers domaines C-terminal et le domaine TM en subissant in vitro le clivage enzymatique de la calpaïne (Redpath et al., 2014; Piper et al. 2017). Cette structure porte une grande similarité structurale avec la famille des synaptotagmines, comportant elles aussi deux domaines C2 et un domaine TM (Fig.13). De plus, ces domaines C2-EF ont été montrés comme pouvant restaurer le phénotype auditif chez le poisson-zèbre déficient pour l'otoferline (Chatterjee et al., 2015). Une étude phylogénétique révèle que ces deux domaines C2 situés en C-terminal sont les plus conservés dans l'évolution concernant la famille des ferlines (Lek et al., 2010). Les domaines C2-EF partagent en effet près de 90% de similarité de séquence entre les mammifères et les mollusques, ce qui suggèrent à ces domaines une fonction essentielle et préservée.

Une étude récente sur la dysferlinopathie de Llanga et al. (2017) a montré une récupération partielle de l'intégrité musculaire suite à une thérapie génique virale permettant la réexpression d'une dysferline réduite dans leur modèle murin déficient pour la dysferline. Cette dysferline raccourcie de 30%, nommée "nano-dysferline" a été construite in silico et ne contient que quatre domaines C2 : les domaines C2-A, B, C et G.

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 Questions abordées durant la thèse :

 Une mini-Otof composée uniquement du domaine TM et des deux domaines C2 adjacents (domaines C2-EF), de façon semblable à la mini-dyferline-C72 et aux synaptotagmines, pourrait-elle restaurer la fonction auditive et/ou l'exocytose synaptique au niveau des cellules ciliées internes chez la souris Otof -/- (Fig.13) ?

 Des mini-Otof construites de façon similaire à la nano-dysferline, avec quatre domaines C2 (C2- ACEF et C2-ACDF) pourraient-elles restaurer la fonction auditive et/ou l'exocytose synaptique au niveau des cellules ciliées internes chez la souris Otof -/- (Fig.13) ?

Figure 13 : Représentation schématique de l'otoferline, la synaptotagmine et de formes courtes de l'otoferline (mini-Otof). La synaptotagmine ne contient que deux domaines C2 et son domaine

TM est en N-ter. Avec une structure similaire à la synaptotagmine et correspondant au site de clivage putatif par de la calpaïne, la mini-Otof C2-EF ne contient que les deux domaines C2 adjacents au domaine TM. Deux mini-Otof raccourcies de façon similaire à la nano-dysferline, avec uniquement 4 domaines C2 (C2-ACEF et C2-ACDF) ont également été générées.

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