Les facteurs incitatifs

Após a caracterização das alterações cromossómicas presentes na linha celular CLS-ACI-1 realizou-se a análise dos "breakpoints" que deram origem aos rearranjos estruturais. Sob um ponto de vista evolutivo, as regiões de "breakpoints" denotam zonas do genoma em que à uma maior probabilidade de ocorrer uma quebra, ou seja, são regiões frágeis. Nesta análise foram comparados, com os "breakpoints" da linha em estudo, os "breakpoints" até à data descritos em tumores/cancro sólidos (figura 21).

Na linha celular CLS-ACI-1 foram identificadas 17 regiões de "breakpoints", destas 11 estão co-localizados com "breakpoints" primitivos e com "breakpoints" tumorais/cancro, 3 estão co-localizados com "breakpoints" derivativos (apenas um está também co-localizado com "breakpoints" tumorais/cancro) e 3 não apresentam associação com qualquer um dos dois tipos de "breakpoints" evolutivos analisados, mas um destes está co-localizado com "breakpoints" tumorais/cancro.

De forma a complementar a análise dos "breakpoints", realizou-se uma análise in

silico com o intuito de averiguar se as alterações cromossómicas detetadas nesta linha

celular são equivalentes às que, até à data, foram associadas ao cancro da mama humano. Para tal recorreu-se às bases de dados "Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology" (2012) e dbCRID (2012) e ao mapa comparativo entre HSA e RNO disponibilizado pelo Ensembl ("release" 69, 2012).

Esta análise permitiu determinar que o cromossoma RNO4, que se encontra em pentaploidia na linha CLS-ACI-1, possui sintenias com o cromossoma HSA7 (anexo 12), cujo ganho tem vindo a ser frequentemente associado com o cancro da mama humano. É neste cromossoma (RNO4/HSA7) que se encontra o oncogene Kras/KRAS. Este gene codifica uma GTPase transdutora que está associada ao cancro da mama e

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cuja forma de ativação é a amplificação génica. O cromossoma RNO4 encontra-se recorrentemente em pentaploidia, na linha CLS-ACI-1, o que nos leva a antecipar que se encontrem, pelo menos, 5 cópias deste oncogene na linha em estudo, sugerindo a sua importância na tumorigénese/progressão da linha CLS-ACI-1. Tal torna esta linha celular, caso se confirme a amplificação do gene Kras, um bom modelo celular in vitro para o estudo do impacto deste gene no cancro.

Outra anomalia cromossómica, frequentemente observada no cancro da mama humano, é o ganho do cromossoma 20 inteiro ou do braço 20q (principalmente da banda 20q13) que possuem sintenia com o cromossoma RNO3q (anexo 12), que, por sua vez, se encontra altamente rearranjado e em número de cópias aumentado na linha celular em estudo.

De acordo com a informação presente no "Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology" (2012) os braços cromossómicos HSA8q, HSA17q e HSA20q constituem hot spots para ganhos em 60%, 25-30% e 20-25% dos cancros da mama, respetivamente. O braço cromossómico HSA17q apresenta sintenia com o cromossoma RNO10 (anexo 12), que mostra ganho perto da região telomérica distal do centrómero na linha em estudo. Como foi referido anteriormente o braço HSA20q apresenta sintenia com o cromossoma RNO3q, que se encontra envolvido em vários rearranjos na linha CLS-ACI-1.

Em HSA, o ganho ou amplificação recorrentes do braço HSA20q, tem vindo a ser associado com um mau prognóstico clínico e contribui, aparentemente, para vários fenótipos associados ao cancro, tais como alguns aspetos da imortalização, instabilidade genómica, apoptose e aumento da proliferação celulares [180]. A amplificação do cromossoma HSA20, está putativamente implicada na desregulação das vias MAPK e P53 e dos fatores proteicos pertencentes ao grupo Polycomb [181].

Em RNO a região do cromossoma RNO3pter-q12, onde se verificou a presença de "breakpoints" na linha CLS-ACI-1, foi implicada na indução de aneuploidia e está, também, associada à tumorigénese [175]. É na região acima apontada que se encontra a banda RNO3p11, que é, independentemente do tipo de tumor, a região onde se verifica, em RNO, a maior incidência de rearranjos estruturais e está associado à frequente perda do RNO3p [175]. Tal está de acordo com o verificado no cromossoma RNO3 da linha

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CLS-ACI-1, onde se verificou a ausência total do braço curto do RNO3 devido à ocorrência de vários "breakpoints" na proximidade imediata do centrómero.

De forma a complementar a análise aos "breakpoints" efetuada anteriormente, comparou-se os "breakpoints" da linha CLS-ACI-1 com os "breakpoints" evolutivos descritos entre RNO e MMU ("breakpoints" derivativos) e os "breakpoints" evolutivos descritos entre RNO e HSA ("breakpoints" primitivos).

Foi determinado que, entre os 17 "breakpoints" exibidos pela linha CLS-ACI-1, 14 se encontram co-localizados com "breakpoints" evolutivos, sendo que 11 destes "breakpoints" estão co-localizados com "breakpoints" primitivos e 3 com "breakpoints" derivativos.

Estes dados estão de acordo com a associação, entre as regiões de "breakpoints" evolutivos e os "breakpoints" tumorais, determinada por Murphy et al., em 2005 [182]. Murphy et al. [182], determinaram que os "breakpoints" tumorais mais frequentes se encontram recorrentemente co-localizados com "breakpoints" evolutivos, denotando alguma semelhança, apesar da diferente escala temporal dos acontecimentos, na dinâmica evolutiva entre a macroevolução (evolução das espécies) e a microevolução (evolução tumoral).

É de salientar que apesar das semelhanças verificadas, ao nível dos "breakpoints", entre os processos macro e microevolutivos, as forças evolutivas/seletivas que atuam nestes é de diferente natureza pois pensa-se que, a nível evolutivo, são favorecidos os rearranjos cujas regiões de "breakpoints" são, frequentemente, sequências que não apresentam função codificante ou reguladora [183], minimizando a alteração nos genes. No entanto, na microevolução, são favorecidos os rearranjos que confiram às células algum tipo de vantagem, pelo que são favorecidos os rearranjos que levem à formação de genes de fusão, cujas proteínas apresentam grande capacidade oncogénica; que levem à inativação de genes supressores tumorais ou que aumentem a expressão de um oncogene, ao coloca-lo sob regulação de "enhancers" ou promotores mais fortes, por exemplo [21, 35].

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V.4 - Análise in silico para determinação de potenciais genes, associados ao