contrôlée ? . . . 61 3.2.1 Méthodes de fabrication existantes . . . 61 3.2.2 Limitations . . . 61 3.3 Cylindres . . . 62 3.3.1 Microfabrication des cylindres superparamagnétiques . . . 62 3.3.2 Mesure de la susceptibilité magnétique des cylindres . . . 68 3.3.3 Calcul de la force d’interaction entre deux cylindres . . . 71 3.4 Reconstitution de gels d’actine in vitro à la surface de colloïdes
superparamagnétiques . . . 76 3.4.1 Méthodes de fonctionnalisation des cylindres . . . 76 3.4.2 Mélange de croissance . . . 77 3.4.3 Préparation de l’échantillon . . . 77 3.5 Montage expérimental . . . 78 3.6 Traitement d’images . . . 80 3.6.1 Corrélation subpixels d’images . . . 80 3.6.2 Détermination des contours des cylindres . . . 83
3.1
Vers une nouvelle méthode de mesure
Les travaux présentés dans le chapitre précédent concernant d’une part la caractérisation mécanique des gels d’actine denses et branchés, et d’autre part l’étude de la polymérisation de gels sous contrainte, laissent de nombreuses questions en suspens.
Cette thèse s’inscrit dans la continuité des travaux de [Pujol et al., 2012] qui utilisent l’auto organisation de colloïdes superparamagnétiques sous un champ magnétique pour étudier les pro- priétés des gels d’actine denses et branchés. L’avantage principal de cette méthode est de pouvoir faire des mesures systématiques en fonction des concentrations des protéines et des sollicitations
mécaniques. Cependant, elle connait quelques limitations.
Son inconvénient est la géométrie sphérique des colloïdes qui limite le champ d’application de cette technique. La croissance se déroulant depuis la surface des colloïdes, elle est contrainte par le gel déjà existant ce qui limite les comparaisons avec la situation in vivo et peut induire des effets couplés avec la non linéarité du matériau. Également, elle ne permet pas d’étudier proprement les effets de rigidification et d’amollissement sous contrainte. En effet la géométrie sphérique impose dans le contact une déformation plus importante au centre que sur le pourtour. Il n’est ainsi pas possible d’appliquer une contrainte contrôlée et de mesurer le module élastique non linéaire. Enfin, il n’est pas non plus possible de maintenir une comète d’actine entre deux billes, ce qui ne permet pas de faire des mesures de force-vitesse (voir figure 3.1).
Dans cette thèse, pour dépasser ces limitations, nous avons développé de nouveaux objets magnétiques de taille micrométrique avec des faces planes. Ils permettent de s’affranchir de la géométrie sphérique, et ainsi d’avoir un gel non contraint, une aire de contact constante au cours de la compression, une contrainte appliquée homogène dans tout le gel, et de pouvoir maintenir une comète grâce à l’orientation des cylindres. L’objectif est d’obtenir directement des courbes contraintes-déformation traduisant les propriétés non linéaires du matériau ainsi que des courbes force-vitesse au cours de la polymérisation permettant de remonter aux mécanismes de généra- tion de forces.
Figure 3.1 – Principe de la mesure. A gauche, les gels poussant sur une surface sphérique sont contraints (1.b), le contact n’est pas homogène (1.a), et il n’est pas possible de maintenir une comète (1.c). A droite, les gels poussent sur des faces planes, permettant de surmonter les difficultés du cas sphérique (2).
Une façon d’accéder à une description plus précise du mécanisme à l’oeuvre dans la géné- ration de forces par la polymérisation de l’actine dans la migration cellulaire est d’obtenir des courbes forces-vitesse. Précédemment, les courbes forces-vitesse générées par des réseaux denses de filaments branchés en croissance ( [Marcy et al., 2004, Parekh et al., 2005]) étaient difficiles à mettre en oeuvre et ont fourni des résultats différents. Les cylindres magnétiques nous per- mettent de réaliser des mesures systématiques en fonction des concentrations de protéines, des partenaires présents, et des forces appliquées.
Ce chapitre est consacré au développement de la nouvelle technique de mesure des propriétés des gels d’actine branchés reconstitués in vitro sur des objets plats. Nous verrons comment fabriquer de tels objets superparamagnétiques, comment faire pousser des gels à leur surface,
3.2. COMMENT FABRIQUER DES MICROPARTICULES MAGNÉTIQUES DE GÉOMÉTRIE CONTRÔLÉE ?61
puis le montage expérimental permettant de réaliser des mesures de mécanique et de génération de forces des gels.
3.2
Comment fabriquer des microparticules magnétiques de géo-
métrie contrôlée ?
L’objectif est de fabriquer des particules superparamagnétiques de tailles micrométriques (quelques micromètres), de géométrie contrôlée, de contenu magnétique important afin d’obtenir des forces de quelques nanonewtons, en grand nombre, faciles à récolter et à manipuler, et biocompatibles. Nous allons passer quelques exemples en revue qui illustrent les méthodes de fabrications actuelles et leurs limitations, et les raisons pour lesquelles nous avons développé une nouvelle méthode.
3.2.1 Méthodes de fabrication existantes
L’idée générale jusqu’ici a été de réticuler (à la chaleur, aux ultra-violets, ...) des objets de forme contrôlée et de les "fourrer" avec des nanoparticules. Pour fabriquer les formes, les tech- niques utilisées sont basées soit sur la lithographie, soit sur le "stop flow". Pour incorporer des nanoparticules, on peut soit les mélanger avec la matrice avant réticulation, soit les synthétiser in situ.
Plusieurs techniques basées sur la lithographie ont été mises en oeuvre ( [Nunes et al., 2010,Su- ter et al., 2011, Suh et al., 2012]). Par exemple, [Nunes et al., 2010] rapporte la fabrication de colloïdes magnétiques en photopolymérisant sous champ magnétique des matrices de polymères chargées en particules de F e3O4 (voir figure 3.2.A). Un exemple de fabrication in situ est celui
du groupe de Patrick Doyle aux États-Unis : Avec une technique de "stop-flow lithography" ( [Dendukuri et al., 2007]), ils synthétisent des particules de polymères comportant des groupes carboxyles capables de capturer des ions F e2+et F e3+qui sont ensuite coprécipités pour former
des nanoparticules magnétiques incorporées dans des matrices de polymères. Ils génèrent des par- ticules avec différents contenus magnétiques en faisant croître successivement les nanoparticules dans le gel, une procédure qui peut être utilisée pour augmenter la magnétisation de saturation jusqu’à 42 emu/g ( [Suh et al., 2012], voir figures 3.2.B 3.2.C).
3.2.2 Limitations
Les nanoparticules ont une forte tendance à s’agréger à cause des interactions de Van der Waals de surfaces dès que la fraction volumique augmente et en pratique, la fraction volumique des nanoparticules est limitée à environ 10% ce qui confère une faible susceptibilité magnétique aux particules fabriquées (voir figure 3.2.A). De plus la présence d’agrégats limite l’homogénéité du dopage et rend très difficile le contrôle de la forme aux échelles micrométriques [Suter et al., 2011]. La fabrication in situ permet d’obtenir un contenu magnétique plus important que par lithographie mais les dimensions typiques rapportées sont de l’ordre de 100 µm ( [Suh et al., 2012]), donc loin des dimensions qui nous intéressent (quelques micromètres). Également, il est
Figure 3.2 – A : Colloïdes superparamagnétiques obtenus par une technique de lithographie. Des agrégats linéaires de F e3O4 sont clairement visibles au MEB. La barre d’échelle est de 10
µm. D’après [Nunes et al., 2010]. B : Schéma du procédé de synthèse in situ, d’après [Suh et al., 2012]. C : Image de microparticules synthétisées in situ, d’après [Suh et al., 2012].
à noter qu’une fois les particules fabriquées, la question de la collecte reste elle aussi délicate [Rolland et al., 2005]. En général, les particules ne sont pas facile à extraire de leur moule, et s’agrègent entre elles ou s’attachent aux parois de leur contenant à cause de leurs propriétés de surface