PARTIE 2 : CARACTÉRISATION DU PROFIL AROMATIQUE DES PRODUITS
3.4. Extraction des composés d’arôme par la technique SAFE
3.4.1. Avant-propos
Il existe deux techniques SAFE décrites dans la littérature que l’on nommera « SAFE direct » et « SAFE indirect » dans la suite de ce manuscrit.
La technique du SAFE direct (Figure 20, ci-contre) consiste à extraire directement les composés d’arôme de la matrice d’intérêt. L’extrait aromatique aqueux obtenu est ensuite soumis à des étapes post-extraction SAFE. Une extraction liquide-liquide au solvant est ainsi opérée puis, l’extrait aromatique organique obtenu est ensuite séché et concentré avant d’être analysé.
La technique du SAFE indirect (Figure 20, ci-contre) demande dans un 1er temps à réaliser des étapes pré-extraction SAFE. Une extraction liquide-liquide ou liquide-solide au solvant organique sur la matrice d’intérêt est réalisée. L’extrait aromatique organique obtenu peut être filtré ou bien centrifugé avant l’extraction SAFE. À l’issue de l’extraction SAFE, l’extrait aromatique organique obtenu est séché et concentré avant d’être analysé.
Au vue des deux méthodes SAFE existantes et d’un précédent travail réalisé en SAFE sur mangue (Munafo, Didzbalis, et al., 2014), les deux techniques SAFE ont été testées afin de choisir un protocole SAFE à suivre pour la suite des travaux de thèse.
Étapes pré-extraction SAFE Extraction liquide-liquide ou liquide-solide ê Filtration/Centrifugation de l’extrait aromatique organique
Extraction SAFE
Extraction sous vide des composés d’arôme
ê
Extrait aromatique aqueux
Extraction sous vide des composés d’arôme
ê
Extrait aromatique organique
Étapes post-extraction SAFE
Extraction liquide-liquide ê
Séchage et concentration de l’extrait organique aromatique
Séchage et concentration de l’extrait organique aromatique
Figure 20. Les techniques SAFE en mode direct et indirect reportées dans la littérature.
Les tests SAFE en mode direct et indirect ont été réalisés sur de la purée de mangue issue d’un lot de mangues Kent en provenance de Côte d’Ivoire (9 mangues, indice de fermeté 50 < ID < 60). La préparation de cette purée test suit le protocole décrit précédemment pour les produits de mangue frais (cf. Partie 1, §3.2, p 62)
3.4.2. Le montage de l’extraction SAFE
Le matériel, le montage et la procédure d’extraction SAFE utilisés dans cette étude s’inspirent des travaux d’Engel et al. (1999). La figure ci-contre illustre le montage SAFE mis en place à l’UMR- QualiSud (Figure 21).
Figure 21. Montage de l’extraction SAFE : (a) schéma du corps du montage SAFE extrait des travaux d’Engel et al. (1999), (b) photo du montage SAFE mis en place au CIRAD.
Par définition, la technique SAFE consiste à extraire les composés d’arôme d’une matrice sous vide poussé, en utilisant un solvant d’entraînement (aqueux ou organique) et en piégeant les composés volatils par des pièges froids (azote liquide).
Pour cela (Figure 21b), le bain thermostaté et le réfrigérant à eau sont placés à 45 °C. La pompe à vide, les 3 pièges à azote liquide (soit 1 dewar pour le ballon B et 2 dewars pour la suite du montage) et les 3 robinets de connexion (R1, R2, R3) permettent d’établir un vide progressif dans le corps du montage SAFE par un jeu d’ouverture et de fermeture des robinets. Le vide est contrôlé via un manomètre numérique (Granville Phillips 375, MKS Instruments, Andover, MA, USA) et est considéré comme optimal lorsque celui-ci atteint 10-3 mbar.
3.4.1. Extraction des composés d’arôme par SAFE direct
Dans le ballon d’extraction (ballon A de 500 mL, Figure 21) sont introduits 60 g de produit de mangue (purée fraîche ou poudre séché de mangue), 100 mL d’eau ultra pure (eau milli-Q), 30 µg d’étalon interne en solution, un barreau aimanté et quelques grains de pierre ponce en PTFE pour réguler l’ébullition.
vide vide vi A B réfrigérant à eau bain thermostaté N2(l) N 2(l) N2(l) N2(l) N2(l) ampoule à addition N2(l) agitateur magnétique chauffant Pompe à vide Partie SAFE
[A] ballon d’extraction
[B] ballon de récupération manomètre A B a b R3 (robinet) vide R1 R2
Au préalable, le produit de mangue est mis à décongeler pendant 1h à température ambiante (23 °C). L’étalonnage interne est réalisé soit à partir d’une solution de nonan-4-ol1
(30.0 µg.mL-1 dans de l’eau milli-Q à 1% de méthanol1), soit à partir d’une solution d’α-cedrène1 (120 µg.mL-1 dans du méthanol1) suivant la richesse du profil aromatique du lot de mangues étudié. Ainsi, 1 mL de solution étalon de nonan-4-ol ou 250 µL de solution étalon α-cedrène ont été ajoutés dans le ballon d’extraction avec le produit de mangue.
Une fois l’extraction SAFE initiée, c’est-à-dire, une fois le montage SAFE fermé et la mise sous vide enclenchée, la 1ère étape d’extraction consiste en l’évaporation de l’eau présente dans le ballon d’extraction A (eau-milli-Q et eau présente naturellement dans le produit de mangue). L’extraction SAFE est opérée à 45 °C et sous vide poussé (10-3mbar). Une fois l’évaporation de l’eau terminée, une heure d’extraction supplémentaire est observée. Au total, 2h à 2h30 d’extraction sont nécessaires pour réaliser une extraction SAFE en mode direct.
L’extrait aromatique aqueux obtenu est mis à décongeler à température ambiante (23 °C) en présence de 100 mL d’un mélange de solvants pentane/dichlorométhane2 (mélange azéotropique C5H12/CH2Cl2, 2:1, v/v). Une extraction liquide-liquide est ensuite opérée avec une ampoule à décanter. La phase organique est mise de côté et la phase aqueuse est reprise avec deux autres volumes de 50 mL de solvant azéotropique. Les 3 extraits organiques sont ensuite réunis, séchés au sulfate de sodium anhydre, puis filtré sur coton préalablement dégraissé.
Environ 200 mL d’extrait aromatique organique sont ainsi obtenus. Celui-ci est ensuite concentré à l’aide d’un concentrateur Kuderna-Danish placé dans un bain thermostaté à 45 °C jusqu’à obtention d’environ 400 µL d’extrait. Celui-ci est à nouveau réduit à 200 µL en utilisant un faible flux d’azote gazeux. L’extrait aromatique organique du produit de mangue est ensuite directement analysé en GC-MS et est conservé à – 80 °C pour de futures analyses. L’extraction SAFE en mode direct est réitérée 3 fois pour chaque produit de mangue.
1Références produits : nonan-4-ol (Alfa Aesar, Karlsruhe, Allemagne), méthanol et α-cedrène (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
3.4.2. Extraction des composés d’arôme par SAFE indirect
Dans un 1er temps, les composés d’arôme des produits de mangue sont extraits directement par une extraction liquide-solide. Dans un erlenmeyer de 500 mL sont introduits 60 g de produit de mangue (purée fraîche ou poudre séché de mangue), 100 mL d’eau ultra pure (eau milli-Q), 100 mL d’un mélange de solvants pentane/dichlorométhane (mélange azéotropique C5H12/CH2Cl2, 2:1, v/v), 30 µg d’étalon interne en solution (soit les solutions étalons de nonan-4-ol ou d’α-cedrène décrites précédemment p 70) et un barreau aimanté. Le produit de mangue est au préalable décongelé pendant 1h à température ambiante (23 °C). L’extraction liquide-solide est réalisée pendant 30 min. à froid (erlenmeyer d’extraction plongé dans un bain de glace), sous agitation à 1000 rpm (IKA basic RH-KT/C, Gmbh & Co. KG, Staufen, Allemagne) et sous atmosphère inerte grâce à l’introduction d’azote gazeux dans la cellule d’extraction.
Le mélange produit de mangue/eau/solvant obtenu est cohésif et visqueux. Celui-ci est centrifugé à 8000 rpm pendant 10 min. à 15 °C (centrifugeuse Beckman Coulter JLA-16.250 rotor, Fullerton, CA, USA). La phase organique est récupérée et le mélange pulpe de mangue/phase aqueuse est à nouveau repris en deux autres extractions liquide-solide avec 50 mL de solvant azéotropiquependant 10 min. dans les même conditions d’extraction que décrites précédemment. Les 3 extraits aromatiques organiques obtenus sont ensuite réunis, séchés au sulfate de sodium anhydre, puis filtrés sur coton préalablement dégraissé.
Environ 200 mL d’extrait aromatique organique sont ainsi obtenus. Celui-ci est ensuite placé dans le ballon d’extraction SAFE (ballon A de 500 mL, Figure 21) avec un barreau aimanté et quelques grains de pierre ponce en PTFE pour réguler l’ébullition.
Tout comme décrite précédemment (p 70), l’extraction SAFE est réalisée à 45 °C et sous vide poussé (10-3 mbar). Une fois l’évaporation du solvant dans le ballon A terminée, une heure d’extraction supplémentaire est observée. Au total, 1h15 à 1h30 d’extraction sont nécessaires pour réaliser une extraction SAFE en mode indirect.
L’extrait aromatique organique obtenu est mis à décongeler à température ambiante (23 °C), puis est concentré dans les mêmes conditions que décrites précédemment. L’élimination du solvant est opérée au Kuderna-Danish à 45 °C, puis sous un faible flux d’azote gazeux jusqu’à obtention d’environ 200 µL d’extrait. L’extrait aromatique organique du produit de mangue est ensuite analysé en GC-MS et est conservé à – 80 °C. L’extraction SAFE en mode indirect est réitérée 3 fois pour chaque produit de mangue.